[发明专利]一种生产D-柠檬烯的酵母及其应用

说明书

本发明属于代谢工程领域，具体涉及一种生产D‑柠檬烯的酿酒酵母及其应用。本发明以酿酒酵母为出发菌株，将自然界中不存在于同一生物体的柠檬烯合成酶基因有机整合到酿酒酵母中，优化外源基因的表达，过表达MVA途径基因关键基因、增加乙酰辅酶A和NADPH前体供应等方面，实现柠檬烯在酿酒酵母中的高效合成，最终得到的菌株相对于原菌株具有较好的生长速率。摇瓶发酵最终实现柠檬烯产量达657mg/L，比原产量提高2.021倍，实现柠檬烯在酿酒酵母中的高效合成，具有较大的应用推广价值。

技术领域

本发明属于代谢工程领域，具体涉及一种生产D-柠檬烯的酵母及其应用。

背景技术

萜类化合物，又称类异戊二烯，由异戊二烯单元组成的化合物及其衍生物构成，是植物的次生代谢产物。柠檬烯属于单环单萜类化合物，化学式为C₁₀H₁₆，是一种来源于植物的天然活性化合物，易挥发，性质较稳定，应用范围较广。在食品工业中，柠檬烯具有防腐保鲜、抑菌、抗氧化等功能；在医药行业中，柠檬烯可以用于制备具有抗肿瘤、祛痰平喘、利胆溶石功能的药物；在香料、洗护行业，柠檬烯做精油、温和洗涤剂等；在农业方面，柠檬烯可用于制备天然源农药，具有环境易降解的优点。2020年，全球柠檬烯市场规模达到了20亿元，预计2026年将达到24亿元，年复合增长率(CAGR)为2.3％。

目前D-柠檬烯的工业生产主要是从植物的果皮或者果肉中提取的，但提取方法存在着分离纯化复杂、产率低、能耗大等缺点。本世纪初合成生物学技术的兴起，为微生物异源合成天然活性化合物带来了全新的理念与工具，打破了物种间的界限，使微生物异源合成D-柠檬烯成为现实。构建定向、高效的异源合成D-柠檬烯的微生物细胞工厂，实现微生物发酵法替换传统的植物提取法，具有重要的经济与社会效益。目前代谢工程应用于柠檬烯的生产主要以酿酒酵母与大肠杆菌为底盘细胞，酿酒酵母作为极具潜力的细胞工厂，被广泛的应用于各种生物燃料、化工产品、医药保健品等的合成，酿酒酵母在萜类化合物的生产中应用较广泛。

2019年国外Codruta Ignea等人采用对正交途径的动态调节，ERG1启动子的动态设计以及关键基因ERG20启动子替换，引入工程化的NPPS等策略，连续发酵实现柠檬烯产量166.0mg/L。2019年Si Cheng等人通过工程改造竞争性基因ERG20的葡萄糖感应启动子HXT1以及引入由植物NPPS和植物LS利用底物NPP组成的OLB途径等策略，补料分批发酵实现柠檬烯产量917.7mg/L。2020年胡智慧等人采用过表达或共过表达MVA关键基因、关键酶启动子优化，关键酶点突变随机突变相结、表达相关转运蛋白以增加耐受性等策略，连续发酵实现柠檬烯产量62.31mg/L。

综上，柠檬烯的传统分离提取技术存在产率低、能耗大等问题，并且受到原料以及地域的限制。关于合成生物学的技术和方法，目前国内外现有技术柠檬烯产量无法满足工业化应用的要求。单萜类物质倾向于粘附或渗透细胞膜，最终导致酵母膜功能受损，因此还会存在柠檬烯对酵母生长的抑制问题。

发明内容

本发明旨在提供一种生产D-柠檬烯的酵母及其应用，从外源柠檬烯合成关键基因整合与优化、过表达MVA途径基因关键基因、增加乙酰辅酶A和NADPH前体供应三个方面，实现柠檬烯在酵母中的高效合成，具有较大的应用推广价值。

按照本发明的技术方案，所述重组酵母，以酵母为出发菌，异源表达截短的柠檬烯合成酶基因tLimS，表达了法尼基焦磷酸突变体基因ERG20^ww，过表达内源MVA合成途径中关键基因和MVA途径相关基因；

所述截短的柠檬烯合成酶基因tLimS由柠檬烯合成酶基因LimS去除前56个氨基酸序列形成；

所述法尼基焦磷酸突变体基因ERG20^ww是对法尼基焦磷酸基因ERG20的96与127位氨基酸进行突变得到；

所述内源MVA合成途径中关键基因为甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因IDI和截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因tHMG1；