[发明专利]一种生产D-柠檬烯的酵母及其应用

权利要求书

1.重组酵母在发酵生产D-柠檬烯中的应用，其特征在于，所述重组酵母以酵母为出发菌，异源表达截短的柠檬烯合成酶基因tLimS，表达了法尼基焦磷酸突变体基因ERG20^ww，过表达内源MVA合成途径中关键基因和MVA途径相关基因；

所述酵母为酿酒酵母；

所述截短的柠檬烯合成酶基因tLimS由柠檬烯合成酶基因LimS去除前56个氨基酸序列形成，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述法尼基焦磷酸合酶突变体基因ERG20^ww是对法尼基焦磷酸合酶基因ERG20的96与127位氨基酸进行突变得到，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述内源MVA合成途径中关键基因为甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因IDI和截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因tHMG1；

所述截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因tHMG1由3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因HMG1去除前530个氨基酸序列形成，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

所述MVA途径相关基因为乙酰乙酰辅酶A硫解酶基因ERG10、β-羟-β-甲戊二酸单酰辅酶a合酶基因ERG13、甲羟戊酸激酶基因ERG12、磷酸甲羟戊酸ERG8和焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶ERG19；

所述法尼基焦磷酸合酶突变体基因ERG20^ww通过与截短的柠檬烯合成酶基因tLimS采用双向诱导型启动子GAL1,10进行表达；

所述重组酵母还将法尼基焦磷酸基因ERG20的启动子替换为葡萄糖感应型启动子，所述葡萄糖感应型启动子为P_HXT1，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述重组酵母还敲除了乙醛酸循环的关键酶苹果酸合成酶基因MLS1，谷氨酸脱氢酶(NAD (+))基因GDH2。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因IDI的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述乙酰乙酰辅酶A硫解酶基因ERG10的核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示，所述β-羟-β-甲戊二酸单酰辅酶a合酶基因ERG13的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示、所述甲羟戊酸激酶基因ERG12的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示、磷酸甲羟戊酸ERG8的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶ERG19的核苷酸序列如SEQ IDNO.10所示。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述双向诱导型启动子GAL1,10的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，依次敲除苹果酸合成酶基因MLS1和谷氨酸脱氢酶(NAD (+))基因GDH2。

5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述发酵的温度为28-32℃，时间为80-120h。

6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述发酵的温度为30℃，时间为96h。