[发明专利]一种基于蛋白冠的血清高丰度蛋白去除方法

说明书

本发明公开了一种基于蛋白冠的血清高丰度蛋白去除方法，其步骤包括：1)制备氧化铁纳米颗粒IONPs，并将所制备IONPs用超纯水定容，得到IONPs储备液；2)将提取的血清稀释后加入IONPs储备液，于室温条件下震荡孵育，使IONPs表面吸附血清蛋白，形成蛋白冠PC；3)对步骤2)所得溶液进行磁分离，使PC从溶液中分离；4)清洗PC，以去除溶液管中吸附不稳定的PC和管壁上残留的血清蛋白；5)对步骤4)清洗后的PC上的蛋白进行蛋白酶切；6)洗脱酶切后的肽段；7)对步骤6)所得的肽段溶液样品进行样品脱盐、样品转移，得到去除高丰度蛋白的血清肽段样品。本发明能够有效的去除血清中高丰度蛋白。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于蛋白冠的血清高丰度蛋白去除方法。

背景技术

对血清中蛋白含量水平变化的检测可以反映出机体的健康状态、是否感染疾病以及给予药物后对机体的影响。血清蛋白的组成具有高度复杂性，而其中的高丰度蛋白严重影响了低丰度蛋白的检出，无法全面、系统、有效地反映机体的真实情况，这极大限制血清样品所提供的生物学信息。

目前研究表明，血清蛋白组成相当复杂(含量变化范围约10个数量级)，主要由体内组织或感染微生物、寄生虫等分泌，血清蛋白组的变化反映了药物暴露、条件或疾病对机体的影响，这些血清蛋白也被称为蛋白质生物标志物。但是血清中的20种高丰度蛋白占有血清总蛋白99％以上的比重，包括白蛋白(50-55％)、免疫球蛋白、转铁蛋白、载脂蛋白等。而剩余的1％是由10000多种低丰度蛋白组成(含量大部分处于μg/L和ng/L水平)，且不包括转录后修饰的蛋白。因此，血清蛋白组学是目前最复杂且最难分析的蛋白组学。目前，液相色谱-质谱联用技术(Liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS)是提高血清蛋白组学研究广度和深度的最常用手段。然而，在分析过程中所有血清蛋白的肽段碎片会根据自身性质随溶剂的极性梯度被洗脱进入仪器，被共洗脱的血清高丰度蛋白信号会严重影响低丰度蛋白信号的检测，最终导致血清蛋白鉴定个数不足以有效反映机体情况。因此，从血清样品中去除高丰度蛋白或富集低丰度蛋白是提高血清蛋白组学的广度和深度的最前端，也是最有效的手段。

蛋白冠(Protein corona,PC)是由蛋白质和纳米颗粒(Nanoparticles,NPs)表面之间的氢键、静电力、溶剂力和范德华相互作用形成的。研究表明这个过程是具有一定无差别性的，可以在一定程度实现血清中高丰度蛋白的去除或者低丰度蛋白的富集。氧化铁纳米颗粒(Iron oxide nanoparticles,IONPs)是一种具有良好磁性和生物相容性的纳米材料，已在生物医学领域具有广泛的应用研究，可用于造影诊断、组织修复、光热治疗、药物载体等。IONPs特有的磁性可以使其在形成PC后借助外加磁场进行分离，不仅避免了常规离心方法导致PC分离不纯的问题，而且利用相对温和的磁力可以避免因离心力导致蛋白团聚而造成的样品损失。

目前商品化的方法采用高丰度蛋白去除离心柱方法(品牌：Thermo Scientific；货号：A36369)，其通过与2mL离心管配套使用，将10uL血清样品负载于离心柱上，用不同溶剂配合离心机实现高丰度蛋白的去除。现有商品化的高丰度蛋白去除离心柱的主要缺点如下：

1)成本高：商品化离心柱套装目前有2种规格，2802元/6根和8477元/24根，最便宜的一根高于350元(处理一个血清样品)，对大批量样品进行处理成本过高；

2)存在样品损失：离心和过柱子方法可能会造成部分蛋白变性团聚，在蛋白重悬和酶解过程种可能无法进行高效的碎片化，造成样品损失。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种基于蛋白冠的血清高丰度蛋白去除方法。本发明结合PC和LC-MS技术有效的实现血清中高丰度蛋白的去除和低丰度蛋白的富集，从血清样品中鉴定到更多种类的蛋白，进而提高血清蛋白组学的广度和深度。

本发明的技术方案为：