[发明专利]一种基于蛋白冠的血清高丰度蛋白去除方法

权利要求书

1.一种基于蛋白冠的血清高丰度蛋白去除方法，其步骤包括：

1)制备氧化铁纳米颗粒IONPs，并将所制备IONPs用超纯水定容，得到IONPs储备液；

2)将提取的血清稀释后加入所述IONPs储备液，于室温条件下震荡孵育，使IONPs表面吸附血清蛋白，形成蛋白冠PC；

3)对步骤2)所得溶液进行磁分离，使PC从溶液中分离，去除溶液管中的溶液；

4)清洗PC，以去除溶液管中吸附不稳定的PC和管壁上残留的血清蛋白；

5)对步骤4)清洗后的PC上的蛋白进行蛋白酶切；

6)洗脱酶切后的肽段；

7)对步骤6)所得的肽段溶液样品进行样品脱盐、样品转移，得到去除高丰度蛋白的血清肽段样品。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，制备所述IONPs的方法为：

11)将1g FeCl₃·6H₂O与2g无水醋酸钠溶解于30mL乙二醇中，50℃水浴磁力搅拌至试剂完全溶解；

12)在步骤11)的溶液中加入6.5mL 1,6-己二胺，50℃下水浴磁力搅拌均匀；将所得均匀溶液转移至50mL聚四氟内衬不锈钢反应釜中，在高温干燥箱中反应6h；反应结束后自然冷却至室温；

13)将步骤12)所得IONPs内核分别用超纯水和无水乙醇清洗多次，每次用强磁铁分离并用超声波清洗仪使IONPs内核重新悬浮，清洗结束后用磁铁分离出IONPs；

14)称取10mg的IONPs，用50mL无水乙醇超声分散均匀；

15)在步骤14)的溶液中加入0.5mL浓度为4M的NaOH溶液和0.5mL正硅酸乙酯；在超声条件下机械搅拌，实现IONPs表面修饰。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将所制备IONPs分别用超纯水和无水乙醇清洗，每次清洗用强磁铁分离IONPs并超声重新悬浮，清洗结束后将IONPs用磁铁分离，用超纯水定容1mL得到IONPs储备液。

4.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，所述IONPs储备液中IONPs的浓度为9.5-10mg/mL。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，形成蛋白冠PC的方法为：取2μL血清至1.5mL低吸附离心管中，用0.01M的PBS溶液稀释100倍至200μL，加入10μLIONPs储备液，于室温条件下600rpm震荡孵育1小时，形成蛋白冠PC。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进行蛋白酶切的方法为：用200μL 0.01M的PBS复溶步骤4)清洗后的PC，加入3μL 200mM的二硫苏糖醇，于55℃下600rpm震荡孵育45min还原蛋白；加入3μL 400mM的碘乙酰胺，于室温下避光静置30min进行烷基化；加入4μL 0.5μg/μL的胰酶溶液，室温下300rpm震荡孵育过夜，加入200uL 0.1％的三氟乙酸终止酶切。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，洗脱酶切后的肽段的方法为：利用200μL0.1％的TFA清洗PC多次，每次磁吸6秒钟分离PC收集上清液并合并至低吸附离心管中，得到肽段溶液样品。