[发明专利]一种高灵敏度检测牛结核病病原的方法

说明书

本发明公开了一种微滴数字PCR法检测牛结核病病原的引物、探针及检测方法，其中引物和探针适用于微滴数字PCR法检测，并且能够准确地检测出牛分支杆菌核酸，与猪链球菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、巴氏杆菌、大肠杆菌、苍白念球菌、布鲁氏菌样本核酸无交叉反应，特异性达100％；检测方法灵敏、准确，利于检测潜伏感染和低量感染，本发明提供的基于微滴数字PCR法高灵敏度检测牛结核病病原的方法，可检测到样本中单个拷贝的牛分枝杆菌。

技术领域

本发明属于细菌分子生物学检测技术领域，具体涉及一种基于微滴数字 PCR检测牛结核病病原的引物、探针及检测方法。

背景技术

牛结核病(Bovine Tuberculosis)是主要由牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)引起的人兽共患传染病，其他结核分枝杆菌复合群病原，如人结核分枝杆菌、田鼠分枝杆菌和山羊分枝杆菌等对牛也具有致病性。

随着畜牧业的发展，我国牛结核病检测的需求，特别是对隐性感染以及活动性结核和非活动性结核的鉴别诊断的需求缺口越来越大。因此，加强牛结核病病原检测技术研究，为疫病的控制、净化，动物健康，公共卫生安全具有重要意义。

目前对动物布病的诊断方法有如下的几种：

1)临床诊断

牛结核病以肺结核最为常见，其次是乳房结核和肠结核，以及淋巴结核、胸膜结核和腹膜结核，有时可见肝、脾、肾、生殖器官、脑、骨和关节结核，严重者可表现为全身性粟粒性结核。根据感染累及器官不同，通常可见呼吸症状、腹泻、泌乳减少、生殖性能紊乱、神经症状等。

肺结核：病初易疲劳，有短促干咳，渐变为脓性湿咳，病情严重者可见呼吸困难，奶量大减；听诊肺区有啰音，胸膜结核时可听到磨擦音；叩诊有实音区并有痛感。

乳房结核：一般先是乳房淋巴结肿大，继而乳腺区发生局限性或弥漫性硬结，硬结无热无痛，表面凹凸不平；泌乳量减少，乳汁稀薄，严重时停止泌乳。

肠结核：多见于犊牛，迅速消瘦，以便秘与下痢交替出现或顽固性下痢为特征，粪便混有黏液和脓。

生殖器官结核：性欲亢进，不断发情但屡配不孕，流产。

神经结核：中枢神经系统受侵害时，在脑和脑膜等可发生粟粒状或干酪样结核，常引起神经症状，如癫痫样发作，运动障碍等。

2)细菌学诊断

分枝杆菌的分离培养及鉴定是诊断的“金标准”。细菌培养以及涂片镜检等病原学检查方法，这是较为常见的一种方法，但是结核菌需要8周左右这一较长时间内进行培养。微生物培养技术是采集病畜的坏死灶等样本做细菌培养，观察菌落生长状况并进行鉴别。但由于分枝杆菌对营养要求较高，分离培养操作过程复杂，培养时间长，需要专业技术人员在生物安全三级以上实验室操作，分离操作过程存在较高的生物安全风险。还受动物感染阶段、样本中病原体数量及检测前抗生素使用等因素影响，常导致细菌污染，不能及时做出诊断而使病情加重，具有明显的局限性，不适合推广应用。

2)血清学诊断

牛结核病血清学诊断包括：结核菌素(PPD)皮内变态反应、体外检测γ干扰素法、ELISA方法等。

结核菌素(PPD)皮内变态反应。该方法是国际贸易指定的试验方法。通过皮内注射结核菌素，根据局部皮肤浸润程度而判断机体对结核菌的细胞免疫应答的一种规范化的结核菌素试验。分为单皮试法(SICT)和比较皮试法 (SICCT)，SICT在检测中仅使用提纯牛结核菌素(PPD-B)；SICCT是在SICT 基础上，检测同时使用禽结核菌素(PPD-A)，以排除环境分枝杆菌尤其是禽分枝杆菌的感染。