[发明专利]一种高灵敏度检测牛结核病病原的方法

权利要求书

1.一种检测牛结核病病原的基于微滴数字PCR方法扩增用的引物和探针，其特征在于，所述引物和探针用于检测序列为SEQ ID NO:1的核酸片段。

2.如权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，所述的引物中，上游引物的序列为SEQID NO:2，下游引物的序列为SEQ ID NO:3。

3.如权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，所述的探针的序列为SEQ ID NO:4。

4.如权利要求3所述的引物和探针，其特征在于，所述的探针采用荧光报告基团和荧光淬灭基团进行修饰。

5.如权利要求4所述的引物和探针，其特征在于，所述的荧光报告基团为FAM；荧光淬灭基团为BHQ1。

6.权利要求1-5任一项所述的引物和探针在制备微滴数字PCR检测试剂盒中的应用。

7.一种微滴数字PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包含有权利要求1-5任一项所述的引物和探针。

8.一种微滴数字PCR检测牛结核病病原的方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：

1)提取待检测对象的核酸样品；

2)将微滴制备仪接通电源进行预热，放入收集反应体系的8联管，根据待检样品数，在控制电脑上选择相应孔道；

3)在15μl dPCR Mix反应缓冲液中加入6μl水，浓度为10μM的2.4μl权利要求1所述的上下游引物和10μM的1.2μl探针，再加入3μl步骤1)中得到的核酸样品，充分混合，得到水相反应体系；

4)将微液滴生成芯片装入芯片适配件，在水相溶液孔中加入30μl步骤3)得到的水相反应体系，在油相溶液孔中加入180μl微滴生成油，盖上微滴生成密封盖，放入微滴制备仪生成微滴；

5)制备结束后，将收集反应体系的8联管取出，进行PCR反应，反应条件为：95℃109i9；接着40个循环，94℃309，55℃609；12℃保持；

6)微滴检测仪接通电源进行预热，将装有反应体系的8联管放入微液滴检测芯片适配件中，微液滴检测芯片放入适配件，确保芯片将8联排管盖刺穿，在芯片孔位加入检测试剂，盖上微液滴检测芯片密封垫盖，放入微滴检测仪中进行样本检测。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的引物和探针的终浓度分别为3009M～1μM和1509M～5009M；优选上游引物和下游引物的终浓度为8009M。

10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的PCR反应温度为49.3～63.4℃。