[发明专利]白血病特异性树突状细胞来源的过表达RAE-1的外泌体无细胞疫苗及其制备方法

说明书

本发明公开了一种白血病特异性树突状细胞来源的过表达RAE‑1的外泌体无细胞疫苗，是将过表达RAE‑1的CML细胞裂解得到的肿瘤细胞裂解物与树突状细胞共培养得到成熟的树突状细胞，分离成熟的树突状细胞的外泌体，对外泌体进行纯化后得到。所述疫苗的制备方法，包括步骤：1)用表达RAE‑1γ的慢病毒转染CML细胞，获得过表达RAE‑1的CML细胞CML‑RAE‑1；2)收集CML‑RAE‑1细胞，裂解，得到肿瘤细胞裂解物；3)用培养液A诱导培养树突状细胞，取含有树突状细胞的培养液A与肿瘤细胞裂解物混合共培养，用培养液B培养树突状细胞直至成熟；4)取培养得到的成熟树突状细胞提取外泌体，纯化后即得。

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种白血病特异性树突状细胞来源的过表达RAE-1的外泌体无细胞疫苗及其制备方法。

背景技术

慢性髓细胞白血病(CML)是一种来源于造血干细胞的骨髓增生性疾病，以9号染色体和22号染色体之间的典型易位为特征，这种易位产生了被称为费城染色体的截短染色体，并产生了bcr-abl融合基因。新形成的融合基因翻译形成了BCR-ABL融合蛋白，其具有很强的酪氨酸激酶活性导致了CML的发生和发展。虽然酪氨酸激酶抑制剂(TKI)伊马替尼作为CML的一线治疗用药可使患者达到一般预期寿命，但仍有超过30％的患者无法达到疾病根除，或者出现耐药或药物不耐受。涉及Abl激酶域的点突变是主要的耐药机制。其中，“看门人”T315I突变是最常见的突变，也是治疗失败的主要原因。虽然帕纳替尼作为第三代TKI对治疗T315I突变有效，但由于其明显的毒副作用，尚未得到广泛应用。因此，迫切需要开发新的治疗策略来防止CML的进展和复发。

肿瘤免疫治疗已被证明是一种有效的治疗方式，并且该疗法彻底改变了血液系统恶性肿瘤的治疗手段。树突状细胞(DCs)作为抗原提呈细胞(APCs)能诱导CD8⁺细胞毒性T细胞(CTL)和CD4⁺辅助性T细胞(Th)的抗肿瘤反应，在偶联先天性免疫和适应性免疫反应中发挥重要作用。尽管以DC为基础的疫苗仍然是癌症免疫治疗的主要选择，但仅有5-15％的患者在接种DC疫苗后出现了客观的临床免疫应答。以DC为基础的疫苗的运用主要障碍之一在于肿瘤微环境介导的免疫抑制，使DC上共刺激信号的表达降低，导致CD8⁺T细胞耐受。此外，CML患者的T细胞显著降低了T细胞抗原受体(TCR)链的表达，这有助于肿瘤免疫逃避。因此，以DC为基础的疫苗对治疗CML患者具有很大挑战性。而树突状细胞来源的外泌体(Dex)在抗肿瘤相关免疫抑制、生物利用度和生物稳定性等方面都优于树突状细胞。值得注意的是，由于Dex在抗肿瘤方面具有明显的优势，现已成为一种新型的无细胞抗肿瘤疫苗。然而，用于靶向治疗CML的Dex疫苗还尚未见报道。

DC细胞在相关刺激因子的作用下，细胞膜向内凹陷以出芽的方式形成含多个小囊泡的多泡核内体(MVEs)，MVEs与细胞膜融合后，经胞吐的作用释放出小囊泡，形成Dex。Dex表面携带有功能性免疫刺激成分，包括主要组织相容性复合体I类和II类(MHC I/MHC II)、细胞间粘附蛋白(ICAM1)和共刺激分子如CD80、CD86等。Dex维持了亲代DC细胞的抗原呈递能力，通过表达MHC I-肽和MHC II-肽复合物激活抗原特异性CD8⁺ T细胞和CD4⁺ T细胞。Dex介导的T细胞活化在肿瘤免疫治疗的应用中发挥着重要作用，更重要的是，Dex同时还表达了NK活化受体，能诱导NK细胞的活化。Dex的多项临床试验结果表明，Dex疫苗在体内安全且具有良好的耐受性。然而这些临床试验结果显示，在接受Dex治疗的患者体内仅观察到较弱的肿瘤抗原特异性T细胞反应，Dex只发挥了很有限的临床疗效。缺乏有效的T细胞成熟信号和T细胞抗原的不足可能是这些临床试验中适应性免疫反应较差的原因。