[发明专利]白血病特异性树突状细胞来源的过表达RAE-1的外泌体无细胞疫苗及其制备方法

权利要求书

1.一种白血病特异性树突状细胞来源的过表达RAE-1的外泌体无细胞疫苗，其特征在于：是将过表达RAE-1的CML细胞裂解得到的肿瘤细胞裂解物与树突状细胞共培养得到成熟的树突状细胞，分离成熟的树突状细胞的外泌体，对外泌体进行纯化后得到；所述过表达RAE-1的CML细胞是用表达RAE-1γ的慢病毒转染CML细胞得到。

2.如权利要求1所述的疫苗，其特征在于：所述CML细胞为T315I突变CML细胞。

3.权利要求1或2所述的疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)用表达RAE-1γ的慢病毒转染CML细胞，获得过表达RAE-1的CML细胞CML-RAE-1；

2)收集CML-RAE-1细胞，裂解，得到肿瘤细胞裂解物；

3)用培养液A诱导培养树突状细胞，培养6-8天后，取含有树突状细胞的培养液A与肿瘤细胞裂解物混合共培养，每1ml培养液A与80-120μg肿瘤细胞裂解物混合，共培养7-9小时后用培养液B培养树突状细胞直至成熟；所述培养液A为完全培养液；所述培养液B为含胎牛血清、GM-CSF、IL-4、TNF-α的完全培养液；

4)取培养得到的成熟树突状细胞提取外泌体，纯化后即得。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤1)中用基于CV186载体构建的表达RAE-1γ的慢病毒转染CML细胞。

5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤2)中所述裂解为通过反复冻融法裂解细胞。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于：步骤2)中所述裂解的具体方法为：用液氮冷冻细胞10min，随后在37℃恒温水浴中解冻，解冻后再次液氮冻结细胞10min，再37℃解冻，经过总共三次重复的冷冻/解冻循环后，通过离心去除细胞碎片，随后将上清通过0.22μm过滤器得到肿瘤细胞裂解物。

7.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤3)中含有树突状细胞的培养液A与肿瘤细胞裂解物在37℃、5％CO₂的条件下共培养7-9小时；

所述培养液A为含有10％胎牛血清、10ng/ml GM-CSF、5ng/ml IL-4的RPMI 1640培养基；

所述培养液B为含有10％胎牛血清、10ng/ml GM-CSF、5ng/ml IL-4、10ng/ml TNF-α的RPMI 1640培养基。

8.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤4)中外泌体的提取方法为：取含有血清的完全培养液通过超离心去除培养液中的外泌体得到去外泌体培养基，将步骤3)培养得到的成熟树突状细胞用去外泌体培养基培养过夜，然后收集培养液的上清液通过离心过滤法纯化。

9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于：所述纯化的具体方法为：收集培养液的上清液后以300g进行离心10分钟以去除细胞和细胞碎片后，连续离心进一步纯化：2000g离心10min，10000g离心30min，以去除细胞碎片；上清液通过0.22μm膜过滤后，4℃100,000g超离心70min；沉淀在预冷的PBS中重悬，4℃100,000g再离心70min，即得到树突状细胞来源的外泌体。