[发明专利]小鼠血栓的检测方法及植物乳杆菌对血栓形成的抑制作用

权利要求书

1.小鼠血栓的检测方法，其特征在于，小鼠血栓的检测方法具体包括以下步骤：

步骤一：材料与试剂，植物乳杆菌KSFY04分离自然发酵酸牛乳，SPF级六周龄的雄性昆明小鼠，体重为23±2g；TNF-α、IL-6和IL-1β检测试剂盒；TRIzol试剂；SYBRGreenPCRMasterMix、qpCR引物；其余试剂均为国产分析纯；

步骤二：仪器与设备，PUN-2048A半自动血凝仪，BX43显微镜，VarioskanLUX多功能酶标仪，StoponePlus定量PCR仪；

步骤三：动物实验，小鼠饲养在温度为20±1℃和湿度为30％～40％的环境下，实验小鼠可自由采食和饮水，小鼠适应性喂养7d后正式开始进行实验；

步骤四：凝血四项检验，将收集到的小鼠心脏血采用半自动血凝仪测量活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶时间(TT)、纤维蛋白原(FIB)和凝血酶原时间(PT)；

步骤五：血清和组织炎症细胞因子测定，将收集到的小鼠心脏血在1500rpm和4℃下进行离心分离10min，去上层血清待用；同时称取0.1g肾脏和肝脏组织，然后向肾脏和肝脏组织中分别加入0.9mL生理盐水，然后在4000rpm和4℃下进行对组织进行均质10min，离心后收集上清液待用；最后按检测试剂盒方法测定血清和组织中的TNF-α、IL-6和IL-1β炎症细胞因子水平；

步骤六：组织切片检测，解剖小鼠后，将小鼠的肾脏、肝脏和尾部组织用10％福尔马林固定；脱水48h后，将组织样品包埋在石蜡中，进行切片，并用苏木精-伊红(HE)染色；最后用光学显微镜观察组织的病理变化；

步骤七：组织mRNA表达检测，分别称取0.1g小鼠尾静脉组织，在组织中加入0.9mL生理盐水进行匀浆，再加入1.0mL的RNAzol提取小鼠尾静脉组织中的RNA；然后观察；

步骤八：小鼠粪便中微生物mRNA表达的测定，称取1.0g小鼠的粪便，根据1.3.5组织mRNA测定方法测定小鼠粪便中微生物的mRNA表达，以检测粪便中微生物的组成；

步骤九：统计学分析，所有实验进行三次平行测定，测定得到的结果以平均值表示，并计算出标准偏差，实验结果表示为平均值±标准偏差；同时采用单因素方差分析计算各组数据之间是否具有显著差异(P0.05)。

2.如权利要求1所述的小鼠血栓的检测方法，其特征在于，在步骤三中，所述的小鼠采取50只昆明小鼠随机分为5组，每组10只，分别为正常组、模型组、药物阳性对照组、LP-KSFY04低浓度处理(LP-KSFY04-L)组和LP-KSFY04高浓度处理(LP-KSFY04-H)组；正常组小鼠每天按计量0.01mL/g腹腔注射生理盐水溶液，其余各组小鼠每日按照0.01mL/g计量腹腔注射0.2％浓度的角叉菜胶溶液，持续10天；同时，药物阳性对照组小鼠每日按计量20mg/kg灌胃双嘧达莫，LP-KSFY04-L组和LP-KSFY04-H组小鼠每日按108CFU/kgand109CFU/kg的计量灌胃LP-KSFY04，双嘧达莫和LP-KSFY04的灌胃同样持续10天；10天后对小鼠实施断颈处死后，记录各组小鼠尾部黑尾(血栓)长度，同时解剖取小鼠心脏血和内脏待测。

3.如权利要求1所述的小鼠血栓的检测方法，其特征在于，在步骤七中，所述的观察方式采用使用超微分光光度法在260nm和280nm处测定提取到RNA的吸光度值，计算RNA纯度和浓度，将RNA浓度调整为1μg/μL；然后通过反转录生成cDNA后，配制含1μLcDNA的反应体系，其余试剂包括10μLSYBRGreenPCRMasterMix、7μL无菌蒸馏水和上下游各1μL引物溶液；在定量PCR仪中进行反应，反应条件为95℃持续60s；95℃持续15s，进行40个循环；55℃持续30s；72℃持续35s；95℃持续30s；55℃持续35s。