[发明专利]一种基于KASP技术用于水稻耐高温基因分型的引物组、检测试剂盒及其应用

说明书

本发明提供了一种基于KASP技术用于水稻耐高温基因分型的引物组、检测试剂盒及其应用，属于分子生物学及作物遗传育种技术领域。基于KASP技术用于水稻耐高温基因分型的引物组包括扩增OsTT1的引物组、扩增SLG1的引物组和扩增SUS3的引物组。本发明对OsTT1、SLG1和SUS3中SNP位点设计引物，通过筛选，去除了引物组合出现的错配、发夹结构、引物二聚体等情况，获得的3组引物组可有效区分等位变异位点，可用于增强水稻耐高温能力。采用所述引物组对16份水稻材料进行3个耐高温基因有利等位变异分析，结果能够明显区分不同水稻种质3个耐高温基因的基因型的检测，为耐高温水稻辅助育种提供了新思路。

技术领域

本发明属于分子生物学及作物遗传育种技术领域，具体涉及一种基于KASP技术用于水稻耐高温基因分型的引物组、检测试剂盒及其应用。

背景技术

水稻(Oryza sativa)是我国的主要粮食作物，在国家粮食安全战略中占有主导地位。随着温室效应和极端异常天气的频繁出现，高温热害已经成为影响水稻生产最重要因素之一，而长江中下游，如江西的大部、湖南的东部、浙江的西南部、四川的东部和广东的东北部等地，作为主要的水稻产区也成为高温热害的重灾区(郑建初等,2005)。高温是严重影响水稻的产量和品质，不仅会导致花粉发育异常，活力下降，还会抑制颖花开放和花药开裂程度，阻碍传粉和受精，造成结实率下降(MATSUI et al.,2002,2005；TAO et al.,2007；Zhang et al.,2007；RANG et al.,2011)。特别是我国长江中下游稻区每年规律性的7月中旬至8月下旬38℃以上极端高温，而这段时间正好是双季早稻的灌浆期，水稻灌浆期是产量和米质形成的关键时期，结果造成“籽粒高温逼熟”，导致秕粒率增加、籽粒充实度下降、产量降低、米质变劣，给水稻生产造成严重损失。因此，开展水稻耐高温种质资源的筛选和水稻品种的耐高温性精准鉴定，以推动水稻耐高温性育种进程，保障国家粮食安全已成为当前水稻研究的一个重要课题。

水稻耐高温性是受多种遗传因素和环境共同调控的数量性状。目前已克隆且存在功能变异的水稻耐热性基因主要有OsTT1(LOC_Os03g26970)、SLG1(LOC_Os12g39840)和SUS3(LOC_Os07g42490)。如OsTT1编码区存在3个单核苷酸多态性(single nucleotidepolymorphism,SNP)位点，其中SNP2位点1个G/A的变化导致其编码的蛋白第99个氨基酸由精氨酸(Arg99)变为组氨酸(His99)，而His99的替换可提高泛素化蛋白的降解效率，从而提高水稻的耐高温能力。依据该单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)可将核心种质材料OsTT1分作两种单倍型，二者存在极显著的耐高温性差异。SLG1编码区存在7个SNP位点，其中第865位T/C和第1839位G/T的变化，分别导致缬氨酸(Val)到丙氨酸(Ala)和缬氨酸(Val)到苯丙氨酸(Phe)的变化，并引起耐高温性差异。这两个SNP在水稻核心种质材料中紧密连锁，利用这个两个SNP中的任意一个都可以将水稻核心种质分成两类，且二者在耐高温表型上存在极显著的差异。利用导致基因功能变异的碱基位点开发标记，筛选野生稻中的有利等位变异，为培育水稻耐高温品种具有重要意义。然而，传统的连锁标记主要是基于与基因连锁的分子标记进行基因型鉴定，不能用来准确鉴定材料目标性状有利基因单倍型组合以及进行定向的改良育种，并且操作复杂、通量小、劳动力消耗量大。因此，开发水稻重要耐高温基因标记，利用基因标记辅助选择耐高温性较好的目标单株，可以大大提高选择效率，加快育种进程。

分子标记技术能够有效的辅助优异基因的选育，但是现有的分子标记技术仍存在许多不便利的因素。常规的分子标记无法摆脱在完成聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction,PCR)之后，进行酶切、电泳、染色和显带检测等系列冗长的步骤，增加了操作和劳动成本，操作也不方便，难于用于大规模的育种应用中。