[发明专利]一种探针引物及其用于伊犁贝母专属性检测的荧光定量PCR检测方法和用途

说明书

本发明提供了一种探针引物及其用于伊犁贝母专属性检测的荧光定量PCR检测方法和用途。所述探针引物是由SEQ ID NO：22‑27所示的DNA序列组成。所述检测方法可有效检出伊犁贝母，专属性强，灵敏度高，可用于药材、饮片或成方制剂中是否存在伊犁贝母的定性或定量检测，具有重要的实用价值和应用前景。

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及药物鉴别检测方法，尤其涉及一种探针引物及其用于伊犁贝母专属性检测的荧光定量PCR检测方法和用途。

背景技术

贝母类药材是常用大宗药材，具有止咳化痰功效，其中川贝母、伊犁贝母和平贝母均收录于《中华人民共和国药典》(简称《中国药典》)，传统认为川贝母效果最佳，且以野生为主，价格在各种贝母药材中居首位；而伊犁贝母和平贝母为种植品,产量较大,价格较低。《中国药典》川贝母的基原来源收录了百合科植物的6个物种,即川贝母Fritillariacirrhosa D.Don、暗紫贝母F.unibracteata Hsiao et K.C.Hsia、甘肃贝母F.przewalskiiMaxim.、梭砂贝母F.delavayi Franch.、太白贝母F.taipaiensis P.Y.Li或瓦布贝母F.unibracteata Hsiao et K.C.Hsia var.wabuensis(S.Y.Tang et S.C.Yue)Z.D.Liu,S.Wang et S.C.Chen，按性状差异又可分为松贝、青贝、炉贝及栽培品。

川贝母市场需求量较大，但野生资源有限，伪品屡见不鲜。常见伪品来源主要有伊犁贝母和平贝母等。川贝母掺伪现象严重扰乱了公平竞争的市场秩序，影响着用药的安全性和有效性，最终侵害了消费者的经济和健康利益。

发明内容

本发明提供了一种探针引物及其用于伊犁贝母专属性检测的荧光定量PCR检测方法和用途。所述检测方法能够有效检出伊犁贝母，专属性强，灵敏度高，可用于药材及饮片或成方制剂中是否混有伊犁贝母的定性或定量检测，具有重要的实用价值和应用前景。

一方面，本发明提供了一种探针引物。所述探针引物其由SEQ ID NO：22-27所示的DNA序列组成。

另一方面，本发明提供了一种用于伊犁贝母专属性检测的荧光定量PCR检测方法。所述方法包括下述步骤：

称取贝母样品及样品前处理；

从所述样品中提取DNA并制备DNA模板；及

选择探针引物；

优化反应条件；

根据不同的检测需求，设定不同的判定依据；其中对于定性检测，根据设定的CT值临界点(如CT35)判定是否检出；对于半定量检测，根据与阳性对照的CT值之差的绝对值作为判定依据，差值越小，含量越高；对于定量检测，一方面同时设置标准品(S)，另一方面采用同体系中双探针标记进行扩增，即包括目的探针(P)和内参探针(C)；供试品中目的探针(P)和内参探针(C)的定量检测比值可表示为△CT(T)，相应的标准品可表示为△CT(S)，△△CT＝△CT(T)-△CT(S)从而目的DNA(伊犁贝母)所占比例计算公式可表示为：供试品(T)/标准品(S)％＝2^{-△△CT绝对值}×100％；

其中，所述方法能够用于检测所述样品中是否含有伊犁贝母；所述探针引物为序列号为SEQ ID NO22-27的探针引物。

在一些实施方式中，每组探针引物包括三个序列，并且当任何一组用于检测时其中所包括的三个序列是同时使用而不拆分。

在一些实施方式中，所述样品为中药材、饮片或成方制剂。

在一些实施方式中，所述提取DNA的步骤采用紫外分光光度法进行定量和纯度测定。