[发明专利]一种TanCAR的构建及其应用

说明书

本发明公开了一种TanCAR，在第3代CAR骨架的基础上构建而成，由识别靶细胞表面靶分子的胞外段部分、跨膜部分及细胞内信号转导部分三部分组成。TanCAR中识别靶细胞表面靶分子的胞外段部分由具有核苷酸序列表中NO1所示的碱基序列的IL13(E13K.R66D.S69D.R109K)突变体序列与具有核苷酸序列表中NO2所示的EphA2scFv序列组成，其IL13(E13K.R66D.S69D.R109K)突变体序列位于识别靶细胞表面靶分子的胞外段部分的5’端，EphA2scFv序列位于识别靶细胞表面靶分子的胞外段部分的3’端，其两段序列由GGGS linker进行连接。其构建方法由合成第三代CAR分子的基因及构建第三代CAR骨架载体、构建新型IL13(E13K.R66D.S69D.R109K)CAR载体及构建新型IL13(E13K.R66D.S69D.R109K)‑EphA2scFv‑TanCAR载体三个步骤组成。经研究表明，基于TanCAR制备T细胞能够用于肿瘤中细胞免疫治疗。

技术领域

本发明属于CART治疗技术领域，具体涉及一种TanCAR的构建及其应用。

背景技术

恶性肿瘤严重危及人类的生命健康。目前对恶性肿瘤的常规治疗仍为手术及放、化疗，这种常规治疗对极大多数肿瘤的疗效仍不十分理想，对与极大多数化疗药物而言，其治疗指数依然很低，即其治疗剂量与毒性剂量较为接近。故这种治疗手段通常伴有明显的毒性作用。因此，研究选择性杀灭肿瘤细胞的方法主要依赖于肿瘤细胞的特异性标记，目前肿瘤的靶向性治疗已经成为研究的热点。近年来，随着生物技术的迅速发展，CAR-T(Chimeric antigen receptor T cell,CAR-T)疗法已经成为一种非常有前途的癌症治疗方法，特别是针对非实体瘤的血液系统肿瘤，取得了非常好的临床治疗效果，目前作为针对B淋巴细胞恶性肿瘤治疗的CAR-T药物已经获得美国FDA及中国SFDA的批准上市。但是，目前CAR-T治疗过程还存在一些问题，特别是针对实体瘤的治疗效果欠佳，因此，如何提高CAR-T针对实体瘤的治疗效果(如针对恶性胶质母细胞瘤的CAR-T治疗效果)，同时降低CAR-T在治疗过程中所存在的副作用，是该领域所面临的巨大的挑战。

用于胶质母细胞瘤治疗的CAR-T细胞所针对的靶抗原主要包括白介素13受体α2(IL13Rα2)、人类表皮生长因子受体2(HER2)、表皮生长因子变异III(EGFRvIII)和促红细胞生成素肝细胞受体A2(EphA2)等。其中，由于IL13Rα2在大约50％-80％的神经胶质瘤中过表达，而在正常脑组织中几乎不表达，因此，IL13Rα2是目前最理想的用于治疗胶质母细胞瘤的靶点。到目前为止，针对IL13Rα2设计的CAR有两种，其中IL13Rα2scFv CAR针对靶抗原是IL13Rα2scFv，而IL13 CAR针对靶抗原的是IL13Rα2的配体IL13。然而，考虑到IL13Rα2scFvCAR中的scFv具有一定的免疫原性以及IL13和scFv对IL13Rα2存在竞争性结合的两方面因素，与IL13Rα2scFv CAR相比，IL13 CAR在应用中更具有优势。正如我们所知，IL13有两个受体，一个是IL13Rα2，另一个是IL13Rα1。尽管IL13对神经胶质瘤细胞高表达的IL13Rα2的亲和力高于其对体细胞中正常表达的IL13Rα1的亲和力，但IL13 CAR仍然存在IL13和IL13Rα1结合后所致的脱靶毒性，因此，其特异性有待提高。

发明内容

针对上述IL13 CAR存在的缺陷，为提高CART在肿瘤的特异性，本发明的目的在于，提供一种新的TanCAR。

本发明另一个目的在于，提供上述TanCAR的构建方法。

为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：