[发明专利]一种通过光交联短肽定向固定化酶的方法

说明书

本发明公开了一种通过光交联短肽定向固定化酶的方法，属于酶工程技术领域。本发明选择蔗糖异构酶(SI)作为模型酶。利用分子模拟软件选择出远离活性位点的区域作为定向固定化区域，随后结合分子对接和分子动力学模拟方法设计与该区域有较高亲和性的光交联短肽，并在其末端引入含有光交联基团的非天然氨基酸4‑苯甲酰基‑L‑苯丙氨酸，序列命名为：VNIGGX(VG)。利用光交联短肽实现酶在树脂微球(EP)表面的定向固定。对光交联定向固定化酶进行酶活力、稳定性与重复使用性的评估。本发明赋予固定化酶良好的耐热性和可重复使用性。与传统的固定化酶相比，本发明结合定向吸附和光交联技术，提供了一种高效环保的定向固定化酶方法。

技术领域

本申请属于酶工程领域，具体设计一种通过光交联短肽定向固定化酶的方法

背景技术

酶是一种具有高催化效率和特异性的生物催化剂，但游离酶的低稳定性和难以回收再利用等缺点限制了其工业应用。固定化酶已被用来克服上述游离酶的缺点，但随机固定化会遮盖酶活性位点，造成酶活力的急剧下降。而定向固定化酶技术因避开酶活性位点结合于载体表面而受到广泛的关注。采用定向固定化的方法固定化酶，可使酶特定位点直接或间接与载体结合，酶活性位点位于载体外侧，天然构象基本保持不变，有利于底物进入到酶活性位点，定向固定化可以使蛋白质在载体表面的取向和构象达到统一，有利于保护酶的催化功能。近年来，定向固定化酶技术在酶工程中发挥着巨大作用，在保留酶活力，改善酶的稳定性及重复使用性等方面取得了非常有益的效果。

光作为一种新型的引导交联反应的工具，其触发的交联反应在非物理接触下可精准控制，提供了较高的时间和空间分辨率，优化了交联反应的体系。光敏分子被分为三大类化合物：二苯甲酮类、二氮嗪类和芳香叠氮化合物。在特定波长的光照下能发生结构的变化，从而引导交联反应。波长为365nm的紫外光便能触发二苯甲酮类的光交联反应。在紫外光照射下，结构中的“酮羰基”经历n到π*的转变形成二自由基，此状态可以从附近活化的“碳氢键”中吸收氢原子并重组形成共价复合物，完成交联反应。光交联反应具有高效、无毒和普适性强的优点，作为一种快速、简单和时空可控的交联方法已广泛地应用于化学、生物、医学和材料等不同研究领域。

发明内容

为克服现在酶固定化方法中存在的缺陷，本发明提供了一种通过光交联短肽定向固定化酶的方法，根据酶的结构计算模拟设计出与之亲和的光交联短肽，光交联短肽在紫外光照下实现酶的定向固定化。该方法包括以下步骤：

(1)远离酶的活性位点进行光交联短肽的设计；

(2)将设计好的光交联短肽连接在载体上；

(3)酶溶液与(2)中得到的载体混合进行吸附反应；

(4)将(3)中得到的混合物进行紫外光照处理，产物经沉淀，洗涤后得到光交联定向固定化酶。

进一步地，步骤(1)中所选择的酶分子，包括却不限于蔗糖异构酶。作为优选，蔗糖异构酶来源于Pantoea dispersa UQ68J。

进一步地，步骤(1)中所选择的模拟软件，包括单不限于Gromacs。作为优选，通过软件Gromacs和POCASA程序，避开蔗糖异构酶的活性中心，选择出蔗糖异构酶的目标固定区域。

进一步地，步骤(1)中选择Auto Dock与MOE软件设计与蔗糖异构酶目标固定区域具有高亲和力的短肽。作为优选，短肽序列为H2N-VNIGGX-COOH，X为光敏性二苯甲酮类非天然氨基酸，包括但不限于4-L-苯甲酰基苯丙氨酸。

进一步地，步骤(2)中所述载体为表面带有环氧基团的材料，包括但不限于环氧树脂。作为优选，环氧树脂载体的材料为聚丙烯酸甲酯，粒径为0.2-200μm。