[发明专利]基于熔解曲线检测结核分枝杆菌复合菌群的方法及试剂盒

说明书

本发明涉及生物检测领域，具体涉及一种基于熔解曲线检测结核分枝杆菌复合菌群的方法及试剂盒。本发明提供一种多重引物，其包括结核分枝杆菌插入序列IS6110、MPB64基因、rpoB基因、katG基因、inhA基因和gyrA基因的特异性引物对和特异性探针。本发明还提供了相应的试剂盒和检测方法。本发明的检测方法可快速鉴别结核杆菌复合菌群，可以同时判定其对异烟肼、利福平和氟喹诺酮类药物的耐药性，具有良好的应用前景。

技术领域

本发明涉及生物检测领域，具体涉及一种基于熔解曲线检测结核分枝杆菌复合菌群的方法及试剂盒。

背景技术

结核病是由结核分支杆菌感染引起的慢性传染病。结核病已成为全球严重的公共卫生问题，耐多药结核病和广泛耐药结核病是目前临床亟待解决的难题之一。因此，快速、准确地检测标本中结核分枝杆菌，对于控制结核病是至关重要的。

利福平为利福霉素类半合成广谱抗菌药，该药对结核分枝杆菌(MTB)和部分非结核分枝杆菌(包括麻风分枝杆菌等)在宿主细胞内外均有明显的杀菌作用。该药物自1971年发明以来，一直是结核化疗方案中的关键药物，而且，利福平耐药是耐多药结核的标志，因此，对结核分枝杆菌利福平耐药性的检测非常必要。

氟喹诺酮类药物又称吡啶酮酸类，属于人工化学合成抗菌药。临床上常用氟喹诺酮类药物主要有诺氟沙星、培氟沙星(Pefloxacin甲氟哌酸)、依诺沙星 (Enoxacin氟啶酸)、氧氟沙星(Ofloxacin氟嗪酸)和环丙沙星(Ciprofloxacin 环丙氟哌酸)。近几年，又不断研制并上市多氟化喹诺酮类新品种，如洛美沙星(Lomefloxacin)、氟罗沙星(Fleroxacin多氟哌酸)和二氟沙星(Difloxacin 双氟哌酸)等。随着喹诺酮类抗菌药物在结核分枝杆菌感染中使用的增多，结核分枝杆菌对该类抗菌药物的耐药率逐渐上升。因此，对氟喹诺酮耐药突变的检测已成为必要。

异烟肼，又名4-吡啶甲酰肼、异烟酸肼，其对结核分枝杆菌有高度选择性、较强的抑制和杀灭作用，其生物膜穿透性好，由于疗效佳、毒性小、价廉、口服方便，故被列为首选抗结核药。由于异烟肼已有约五十年的使用历史，部分病人所感染的结核菌已经产生了耐药性，因此对异烟肼耐药突变的检测也具有必要性。

目前，临床上采用的耐药检测方法可分为表型检测和分子检测两类。表型检测法是建立在培养基础上的，通过对比观察结核分枝杆菌在含药和不含药培养基中的生长情况来检测其耐药性，是目前耐药性检测的“金标准”。绝大多数常用的表型检测需要结核分枝杆菌纯培养物，其生长慢的特性决定了该方法需花费较长时间，而且可能因为生长不良或其他微生物污染而导致结果的不确定性。

已有的基因型检测方法有实时荧光定量PCR法、基因芯片法、反向杂交法、 DNA测序法等，但存在操作步骤繁杂、对人员技术水平要求较高，设备昂贵，无法检测所有突变区域等缺点。因此，本领域亟需开发一种操作简便、快速、灵敏度高、特异性强、可对多种药物耐药性结核分枝杆菌同时进行检测的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于熔解曲线检测结核分枝杆菌复合菌群的方法及试剂盒，本发明以探针熔解曲线技术为依托，开发得到一种可快速鉴别结核杆菌复合群方法，可以同时判定其对异烟肼、利福平和氟喹诺酮类药物的耐药性。

为此，第一方面，本发明提供一种检测结核分枝杆菌复合菌群的多重引物，其包括插入序列IS6110、MPB64基因、rpoB基因、katG基因、inhA基因和gyrA 基因的特异性引物对；所述特异性引物对的序列为：

F-IS6110：CTCAGCGGATTCTTCGGTCGTGGTC(SEQ ID NO：1)；

R-IS6110：TGAGGTCGCCCGTCTACTTGGTGTT(SEQ ID NO：2)；

F-MPB64：ACATCAGCCTGCCCAGTTACTACCC(SEQ ID NO：3)；