[发明专利]一种受化学调控的蛋白酶工具及其配套底物

说明书

本发明属于分子生物学技术领域，具体提供了一种受化学调控的蛋白酶工具及其配套底物。所述蛋白酶工具包括HIV‑1蛋白酶突变体和DmrB结构域；所述DmrB结构域通过柔性肽段与所述HIV‑1蛋白酶突变体进行连接；所述HIV‑1蛋白酶突变体通过对天然条件下介导HIV‑1蛋白酶二聚的氨基酸位点进行突变获得。本发明将蛋白酶工具由异源二聚形式改变为同源二聚形式，在进行细胞实验时所需转入的蛋白酶工具元件由两个减少为一个，缩短蛋白酶工具的氨基酸序列长度，结构更精简。此外，本发明提供的蛋白酶工具与其配套的底物共同使用时，可实现人工信号输入在哺乳动物细胞内信号通路的控制。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种受化学调控的蛋白酶工具及其配套底物。

背景技术

通过合成生物学手段对细胞内信号通路进行人工干预，实现对细胞行为的人工控制具有重要的临床诊断治疗价值。蛋白酶具有通过水解肽键从而改变蛋白质底物状态的功能，包括使水解后的蛋白质底物失去原有活性和移除底物中原有的抑制性结构域而使蛋白质底物具有下游活性。因此蛋白酶可以在干预细胞内信号转导的过程中被应用为一种有效的分子工具。为了实现对蛋白酶的水解活性进行人为控制，对蛋白酶进行工程化改造是一种比较常用的技术手段。目前通用的策略是将完整的蛋白酶拆分裂为两个结构域，再将两个蛋白酶结构域分别与可诱导的异源二聚结构域以柔性方式连接。目前已经发表的六种分裂式可诱导蛋白酶分别由下列蛋白酶改造而来：烟草蚀纹病毒蛋白酶(TEVp)、芜菁花叶病毒蛋白酶(TUMVp)、烟草脉斑驳病毒蛋白酶(TVMVp)、向日葵轻度花叶病毒蛋白酶(SuMMVp)、大豆花叶病毒蛋白酶(SbMVp)和李痘病毒蛋白酶(PPVp)。

人工信号输入细胞，诱导异源二聚结构域二聚，进而使分裂的蛋白酶结构域重新聚合成为有活性的完整蛋白酶结构，恢复蛋白酶的水解活性，从而开启下游的信号过程。上述的病毒蛋白酶均为内切酶，具有准确的氨基酸识别切割序列。在蛋白酶目标底物中引入相对应的蛋白酶识别切割序列构成人工蛋白酶底物，与其相对应的蛋白酶配套使用以实现特定的胞内信号控制效果。

现有可响应人工信号调控的蛋白酶工具都是基于“分裂蛋白”的技术路线实现的。这意味着这些可调控蛋白酶工具都必须以异源二聚的形式进行激活。在构建这样的蛋白酶工具的过程中，需要分别对分裂后的两部分蛋白酶结构域进行构建和优化，在后续的使用中，需要同时将异源的两部分蛋白酶元件同时转染进哺乳动物细胞中。因此现有的可调控蛋白酶技术手段具有一定局限性：一是分裂后的蛋白酶一定为异源二聚的形式限制了一些高效的同源二聚蛋白结构域被应用到蛋白酶工具的构建中；二是每构建一种蛋白酶工具都需要同时构建、优化以及转染两部分蛋白质结构域，增加了构建过程的工作量和在病毒转染载体上占据的有效包装容量。

基于这一情况，本发明使用基于突变天然同源二聚蛋白酶的技术路线开发了可受人工调控的同源二聚型蛋白酶工具，同时开发了一系列可与该新型蛋白酶配套使用的蛋白酶底物，以在细胞中实现不同的调控功能。

发明内容

本发明的目的是克服现有可调控蛋白酶技术手段具有一定局限性的问题。

为此，本发明提供了一种受化学调控的蛋白酶工具，所述蛋白酶工具包括HIV-1蛋白酶突变体和DmrB结构域；所述DmrB结构域通过柔性肽段与所述HIV-1蛋白酶突变体进行连接；所述HIV-1蛋白酶突变体通过对天然条件下介导HIV-1蛋白酶二聚的氨基酸位点进行突变获得。该蛋白酶受化学小分子AP20187诱导后二聚激活。

进一步的，为了在减弱天然HIV-1蛋白酶同源二聚活性的同时，又能保证突变体蛋白酶可以在所连接的化学诱导二聚结构域所介导的二聚下重新恢复催化活性，上述HIV-1蛋白酶突变体为T96A突变体或N98D突变体；其中，所述T96A突变体为将HIV-1蛋白酶第96位的苏氨酸突变为丙氨酸的突变体；所述N98D突变体为将HIV-1蛋白酶第98位的天冬酰胺突变为天冬氨酸的突变体。

进一步的，上述柔性肽段的氨基酸序列为SGGGSGGGSGGG。