[发明专利]一种生产7-O甲基圣草酚的重组大肠杆菌及应用

说明书

本发明公开了一种生产7‑O甲基圣草酚的重组大肠杆菌及应用，属于基因工程和生物工程技术领域。本发明在大肠杆菌中异源表达来源于Perillafrutescens的甲氧基转移酶基因，实现了7‑O甲基圣草酚的合成。并通过内源强化甲硫氨酸合成途径、动态调控ATP、强化5’‑磷酸吡哆醛的合成进而整体调控转硫路径、分批添加底物等多种方式，提高了7‑O甲基圣草酚的积累量，最佳工程菌株7‑O甲基圣草酚产量达到306mg/L，为工业化生产7‑O甲基圣草酚提供了一种新的方法。

技术领域

本发明涉及一种生产7-O甲基圣草酚的重组大肠杆菌及应用，属于基因工程及生物工程技术领域。

背景技术

甲基化是黄酮类化合物基本结构形成后常见的修饰反应，甲基化后的黄酮类化合物水溶性和脂溶性较原黄酮类化合物都有所增加，从而进一步增加了黄酮类化合物的应用价值。7-O甲基圣草酚是从北美圣草中提取出的一种活性物质，除了具有常见的黄酮类化合物的抗炎、抗细菌等功效之外，据美国索尔克生物研究所于2019年2月20日发布的研究成果显示，7-O甲基圣草酚也能够治疗阿尔茨海默症；研究人员通过测试对小鼠神经细胞能量消耗，以及其他与年龄相关的神经毒性的影响等，证明了7-O甲基圣草酚可以防止神经衰弱且能缓解记忆衰退；另外，7-O甲基圣草酚能够保护角质免受辐射和年龄的影响，从而在防止头发变灰方面具有一定的功效，且可以帮助黑发再生。

传统化学合成法对反应条件要求高，会产生很多不需要的副产物，产物收率低。因此，可以考虑应用基于代谢工程、基因工程的生物合成法获取甲基化黄酮类化合物。目前还没有研究报道了7-O甲基圣草酚的生物合成，理论上其可以由7-FOMT催化圣草酚7-OH进行甲基化反应合成。目前已有研究者证明了多个7-OH甲氧基转移酶可以催化黄酮类化合物7-OH甲基化反应，比如来源于紫苏叶的甲氧基转移酶pFOMT3，来源于链霉菌的SaOMT2等。然而，甲基化反应过程中需要甲基供体S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的参与，由于大肠杆菌自身SAM的供应不足，可能会限制7-O甲基圣草酚的合成。因此如何利用生物法合成7-O甲基圣草酚并获得较高的产量是目前亟需解决的问题。

发明内容

为实现7-O甲基圣草酚的生产，本发明通过在大肠杆菌中表达了来源于紫苏叶的7-OH甲氧基转移酶基因pFOMT3，实现了7-O甲基圣草酚的合成。接着，通过强化内源甲硫氨酸的供应途径基因MetA、CysE的表达，进而增加了S-腺苷甲硫氨酸的供应。然后引入了来源于枯草芽孢杆菌的ydaO来动态调控胞内ATP的含量，以及异源表达来自酿酒酵母的5’-磷酸吡哆醛合成酶SNZ3和能够调控胞内腺苷、吡哆醛、吡哆胺含量的RPS18B、RFC4，其中吡哆醛、吡哆胺可以进一步转化为5’-磷酸吡哆醛，进而能够整体调控转硫路径和胞内能量代谢。最后分批添加圣草酚至合理浓度获得了高效合成7-O甲基圣草酚的菌株。

本发明提供了一株合成7-O甲基圣草酚的重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌是以大肠杆菌BL21(DE3)为出发菌株，在大肠杆菌中表达来源于Perilla frutescens的甲氧基转移酶基因pFOMT3。

在一种实施方式中，所述重组大肠杆菌中过表达大肠杆菌内源基因MetA和cysE，从而强化内源甲硫氨酸的生物合成途径；所述基因MetA和cysE分别为高丝氨酸琥珀酰转移酶和L-丝氨酸-O乙酰转移酶的编码基因。

在一种实施方式中，表达来源于枯草芽孢杆菌的ATP核糖体感应开关ydaO基因，实现细胞内ATP的动态调控。

在一种实施方式中，在大肠杆菌中异源表达来源于酿酒酵母的SNZ3、RPS18B、RFC4基因来调控胞内5’-磷酸吡哆醛的含量来调控转硫路径及胞内的能量代谢；所述SNZ3、RFC4、RPS18B基因分别为编码5’-磷酸吡哆醛合成酶的基因、编码DNA结合蛋白的基因、编码核糖体亚单位的基因。

在一种实施方式中，所述基因pFOMT3、OsNOMT、SaOMT2的核苷酸序列如SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。