[发明专利]一种肿瘤干细胞获取方法

说明书

本发明提供了一种肿瘤干细胞获取方法，该方法将胶质瘤细胞系进行干性培养，干性培养过程中对细胞进行低温刺激等手段，以激活并扩增起始肿瘤干种子细胞，然后利用干性相关标志物进行分选，分选后培养过程中去除贴壁的无干性特征的胶质瘤细胞，剩余悬浮细胞可进行重复多次的肿瘤球培养即肿瘤干细胞。本发明所述的肿瘤干细胞获取方法可以快速扩增干性较强的细胞，为后期的分选、培养提供大量的肿瘤干种子细胞，本方法适用于大规模肿瘤干细胞库建库使用，以满足常规肿瘤生物医学基础研究、临床研究以及抗肿瘤药物开发等工作需求。

技术领域

本发明属于细胞生物学领域，尤其是涉及一种肿瘤干细胞获取方法。

背景技术

肿瘤干细胞(CSCs)是一种具有类似于体细胞干细胞能力的癌细胞亚群。CSCs在肿瘤的发生、转移、复发和耐药过程中起着关键作用。绝大部分的肿瘤被认为起源于CSCs，这可能是导致肿瘤临床治疗原发性和获得性耐药的重要原因之一，因此，近年来对于肿瘤干细胞的研究吸引了国内外肿瘤基础科研的广泛关注。

目前肿瘤干细胞主要从肿瘤组织及肿瘤细胞系中获得，由于从临床来源的肿瘤组织获得有限，且部分肿瘤组织需要进行临床病理分析，用来分离肿瘤干的大部分肿瘤组织以癌旁组织为主，这也制约着肿瘤干细胞的获取。从肿瘤细胞系获得肿瘤干细胞也存在一定局限，比如肿瘤细胞系具备干性的细胞比例低，利用磁珠或者流式细胞仪分选时会造成一定干细胞的损失，最终导致获得的肿瘤干细胞偏低或者分离失败等风险。

发明内容

有鉴于此，本发明旨在提出一种肿瘤干细胞获取方法，以肿瘤干细胞分选前进行干性培养，并通过低温刺激等方法，以激活并扩增起始肿瘤干种子细胞，并通过磁珠/流式分选，并在分选后培养过程中去除贴壁的无干性特征的胶质瘤细胞，以获得肿瘤干细胞，为目前肿瘤干资源匮乏提供了夯实的技术基础。

为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

一种肿瘤干细胞获取方法，该方法包括如下步骤：

1)胶质瘤细胞系U118MG干性培养，并在培养过程中进行低温刺激；

2)免疫磁珠分选；

3)分选后差速贴壁纯化；

4)肿瘤干快速扩增。

进一步，低温刺激的方法为：在4℃-10℃的环境下培养1-5次，每次10-30分钟。

进一步，步骤1)具体包括如下步骤：将U-118MG细胞接种在肿瘤干细胞培养基中培养3-5天，肿瘤干细胞培养基为包含1-40ng/ml的bFGF、1-20ng/ml的EGF、0.5-4％的B27-50x、0.1-0.4％青链霉素-100x的DMEM/F12无血清完全培养基。

进一步，在进行步骤1)之前还包括U118MG细胞复苏和U-118MG细胞传代。

进一步，U118MG细胞复苏包括如下步骤：从液氮罐中取出冻存的U-118MG细胞，迅速置于37℃水浴锅内快速解冻，然后吸取细胞悬液到预先放置的盛有6mL预热的基础培养基的离心管中离心，弃去上清液后对细胞进行培养。

进一步，U-118MG细胞传代以U-118MG细胞生长密度达到培养瓶底面积的95％以上进行细胞传代，包括如下步骤：使用胰酶对培养后的细胞进行消化，消化终止使细胞复悬；对细胞悬液进行离心，弃上清，之后进行细胞培养。

进一步，步骤2)具体包括如下步骤：

1)对步骤1)得到的细胞结构进行消化处理并重悬，对细胞悬液离心，收集细胞沉淀，并再次重悬；

2)向细胞悬液中加入FcR阻断试剂、CD133磁珠，充分混匀后在冰箱中孵育；