[发明专利]一种肿瘤干细胞获取方法

权利要求书

1.一种肿瘤干细胞获取方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：

1)胶质瘤细胞系U118MG干性培养，并在培养过程中进行低温刺激；

2)免疫磁珠分选；

3)分选后差速贴壁纯化；

4)肿瘤干快速扩增。

2.根据权利要求1所述的肿瘤干细胞获取方法，其特征在于：低温刺激的方法为：在4℃-10℃的环境下培养1-5次，每次10-30分钟。

3.根据权利要求1所述的肿瘤干细胞获取方法，其特征在于：步骤1)具体包括如下步骤：将U-118MG细胞接种在肿瘤干细胞培养基中培养3-5天，肿瘤干细胞培养基为包含1-40ng/ml的bFGF、1-20ng/ml的EGF、0.5-4％的B27-50x、0.1-0.4％青链霉素-100x的DMEM/F12无血清完全培养基。

4.根据权利要求1所述的肿瘤干细胞获取方法，其特征在于：在进行步骤1)之前还包括U118MG细胞复苏和U-118MG细胞传代。

5.根据权利要求4所述的肿瘤干细胞获取方法，其特征在于：U118MG细胞复苏包括如下步骤：从液氮罐中取出冻存的U-118MG细胞，迅速置于37℃水浴锅内快速解冻，然后吸取细胞悬液到预先放置的盛有6mL预热的基础培养基的离心管中离心，弃去上清液后对细胞进行培养。

6.根据权利要求4所述的肿瘤干细胞获取方法，其特征在于：U-118MG细胞传代以U-118MG细胞生长密度达到培养瓶底面积的95％以上进行细胞传代，包括如下步骤：使用胰酶对培养后的细胞进行消化，消化终止使细胞复悬；对细胞悬液进行离心，弃上清，之后进行细胞培养。

7.根据权利要求1所述的肿瘤干细胞获取方法，其特征在于：步骤2)具体包括如下步骤：

1)对步骤1)得到的细胞结构进行消化处理并重悬，对细胞悬液离心，收集细胞沉淀，并再次重悬；

2)向细胞悬液中加入FcR阻断试剂、CD133磁珠，充分混匀后在冰箱中孵育；

3)对孵育后的细胞清洗、离心、重悬，之后加入分离柱中洗去未标注的细胞CD133细胞，使阳性细胞CD133⁺留在分离柱内。

8.根据权利要求1所述的肿瘤干细胞获取方法，其特征在于：在步骤3)之后、步骤4)之前还包括对肿瘤干细胞的鉴定。

9.根据权利要求8所述的肿瘤干细胞获取方法，其特征在于：肿瘤干细胞的鉴定包括如下步骤：

1)收集培养后的细胞并进行消化，向细胞中加入4％多聚甲醛固定液固定15min，之后离心并复悬；

2)分别向细胞悬液中加入FITC-CD133、APC-OCT4、PE-CD44抗体各2μL，室温避光孵育1h；

3)PBS清洗去除未结合的CD133、OCT4、CD44抗体；

4)进行流式细胞仪检测。