[发明专利]一种信号肽及促进胶原蛋白在谷氨酸棒杆菌中分泌表达的方法

说明书

本发明公开了一种信号肽及促进胶原蛋白在谷氨酸棒杆菌中分泌表达的方法，属于基因工程技术领域。本发明提供了编码胶原蛋白的核苷酸序列，并搭建了谷氨酸棒杆菌分泌表达具有三股螺旋结构的重组胶原蛋白的平台，并通过引入6种不同信号肽(CspB、PorB、Cg1514、CgR0949、Cg2052或TorA)构建重组表达载体，及通过对培养基、起始诱导菌浓、诱导时长、IPTG浓度、溶氧等条件的优化，使胶原蛋白的产量达75mg/L，胶原域产量约30mg/L。本研究为重组胶原蛋白在谷氨酸棒杆菌中的高效分泌表达奠定了基础。

技术领域

本发明涉及一种信号肽及促进胶原蛋白在谷氨酸棒杆菌中分泌表达的方法，属于基因工程技术领域。

背景技术

胶原蛋白是哺乳动物体内含量最多的一类蛋白质，是动物结缔组织和细胞外基质(ECM)的重要组成成分。胶原蛋白典型的三股螺旋结构决定了其具有良好的生物力学性能和生物相容性，在医药组织工程、化妆品、食品等领域应用广泛。胶原蛋白的获取可通过动物提取，但具有潜在的免疫原性，有安全隐患；也可通过转基因动植物表达和化学合成获得，但价格昂贵、产量低；微生物发酵表达重组胶原蛋白由于具有安全性高、成本低、产量高、序列设计灵活等优点，近年来受到人们的关注。

目前重组胶原蛋白常用的表达系统有大肠杆菌(Escherichia coli)和毕赤酵母(Pichia pastoris)，大肠杆菌具有发酵周期短、表达量高、便于遗传操作等特点，将来源于化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)的胶原蛋白Scl2在大肠杆菌中表达，在缺乏脯氨酸羟化酶修饰的情况下，仍能形成稳定的三螺旋结构。但由于大肠杆菌外膜的屏障作用，外源蛋白多为胞内表达，且易形成包涵体。酵母作为真核表达系统，可进行翻译后修饰，并且无致病性，但是分泌的胶原蛋白大多为单链，分泌带有三股螺旋结构的胶原蛋白一直是研究的难点。

谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)是公认的符合食品安全标准的宿主，含有丰富的信号肽序列，并且具有单层膜结构，胞外很少检测到蛋白酶活性，是很有潜力的异源蛋白分泌表达的宿主，目前还未有胶原蛋白在谷氨酸棒杆菌中表达的相关报道。

发明内容

为了解决上述胶原蛋白常用表达系统存在的问题，本发明通过在谷氨酸棒杆菌中建立胶原蛋白的分泌表达体系，通过发酵条件优化进一步提高胞外分泌产量，使胞外具有三股螺旋结构的胶原蛋白V-B在信号肽PorB的介导下产量由0提高到75mg/L，三股螺旋结构的胶原域B产量约为30mg/L，是发酵条件优化前的3倍。该方法能有效指导具有三股螺旋胶原蛋白的分泌表达，同时也为谷氨酸棒杆菌分泌表达信号肽的选择提供参考。

本发明提供了一种编码胶原蛋白的DNA分子，含有SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列。

本发明还提供携带所述DNA分子的质粒。

在一种实施方式中，所述质粒包括但不限于pXMJ19系列质粒。

本发明还提供了可向胞外分泌具有三股螺旋结构的胶原蛋白的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)，所述谷氨酸棒杆菌表达了如所示的序列；其中，非胶原域V-domain的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；胶原域B的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；Signal区域含SEQ IDNO.3～8任一所示序列编码的信号肽。

在一种实施方式中，所述非胶原域V-domain和胶原域B之间添加胰蛋白酶识别位点LVPRGSP。

在一种实施方式中，所述非胶原域V-domain的N端添加6×His标签。

在一种实施方式中，所述谷氨酸棒杆菌以pXMJ19系列质粒为表达载体。

在一种实施方式中，所述宿主包括谷氨酸棒状杆菌ATCC13032。