[发明专利]一种人源膜联蛋白人源膜联蛋白A5突变体二聚体的晶体结构及其解析方法

说明书

本发明公开了一种人源膜联蛋白A5突变体二聚体的晶体结构及其解析方法，所述的人源膜联蛋白A5突变体二聚体的晶体结构的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述的人源膜联蛋白突变体二聚体的晶体结构的一个晶格由4个蛋白分子组成，分别为：chain A、chain B、chain C、chain D；所述的蛋白晶体每个单分子含有4个repeat，所述的每个repeat由5个α螺旋和连接它们的loop组成。本发明所提供的突变体蛋白的结构信息可以用于更高效地开展制备检测试剂、诊断试剂盒制备、药物靶点筛选和治疗效果更好的变体蛋白研发，满足生物制药应用的要求。

技术领域

本发明涉及医药工程技术领域，具体涉及一种人源膜联蛋白A5突变体二聚体的晶体结构及其解析方法。

背景技术

研究表明，膜联蛋白A5(Annexin A5)简称ANXA5，是一种320个氨基酸组成的单链蛋白，研究早期其又被称为胎盘抗凝蛋白I、凝血酶抑制剂V、内皮素II、钙结合蛋白I和脂皮质素V。早在1985年，研究报道将其描述为血管抗凝剂，之后它又成为第一个被表征三维结构的膜联蛋白，表明对其的结构解析具有十分重要的研究价值。

研究表明，ANXA5蛋白结构重复序列I至IV组成，其蛋白序列226位上的ASP以Ca2+和pH依赖的构象方式参与调控分子开关。ANXA5与Ca2+结合时的构象，发现在ANXA5重复序列III第187位上暴露的Trp与磷脂结合，此外，ANXA5内部的域间形成了由I/IV和II/III组成的交互作用方式。其中，I和IV之间的相互作用是由NH2末端以非共价方式介导产生，而重复序列II和III通过短螺旋转动方式共价连接。

研究表明，ANXA5是一种单体结构，但与磷脂膜结合时，三个ANXA5单体会自发形成三聚体，而形成的三聚体可以通过三聚体-三聚体相互作用的方式在暴露有磷脂酞丝氨酸(PS)的表面组装。在涉及到抗炎、纤溶和抗血栓过程中，细胞内的ANXA5会在二维晶格中自组装，进而改变细胞膜的曲率以及细胞形状，最终促进细胞膜的修复。

研究表明，细胞内的ANXA5在质膜上表现出钙通道活性，它能与血小板中的肌动蛋白相互作用，是凝血过程的关键调节因子。另外，在血液凝固过程中需要血小板的激活，以形成一个以PS为主的磷脂膜催化表面，使凝血因子X、凝血酶原等凝血固子活化。由于膜联蛋白具有较强的钙依赖性磷脂结合活性，因而能够竞争性抑制凝血因子和血小板膜磷脂的结合，从而抑制了凝血因子X等的活化，起到抗凝血的作用。

综上所述，Annexins是一类钙离子依赖型的磷脂结合蛋白，能够调控抗凝血、细胞凋亡、信号转导等过程，并参与多种疾病的发生发展。ANXA5是膜联蛋白家族分布最多和最广泛的成员，最早被称为抗凝蛋白，主要起抗凝血的功能，通常作为抗凝剂和抗血栓形成的药。近几年，对于寻找与PS结合能力更强、抗血栓能力更强和毒性更小的ANXA5突变体成为研究热点。本发明提供了一个构建此类突变体的新思路，即通过在ANXA5的C末端添加一个半胱氨酸，能够通过形成分子间的二硫桥的构建提高分子间的聚集作用，在竞争性抑制凝血因子和血小板膜磷脂的结合中发挥更强的作用。

目前，X-射线单晶衍射方法是通过蛋白质单晶获得其三维结构的最重要的研究方法之一。对于X-射线单晶衍射方法，蛋白质单晶必须达到足够大的尺寸和完善程度。然而，由于溶液中蛋白质分子之间的相互作用位点较少，相互作用力比较弱，蛋白质晶体中往往含有很大比重的水，因此，内部结构比较规整的蛋白质晶体仍旧很难获得。获得高质量的蛋白质晶体仍旧是蛋白质结构解析的瓶颈问题。

发明内容

本发明提供了一种低毒性、高活性的人源膜联蛋白A5突变体二聚体的晶体结构及其解析方法。

本发明提供的一种低毒性、高活性的人源膜联蛋白A5突变体二聚体，与人源膜联蛋白A5相比较，其毒性大大降低、安全性显著提高；人源膜联蛋白A5突变体二聚体蛋白的PS结合能力是人源膜联蛋白A5的4.5倍。