[发明专利]基于七重PCR技术的肉类检测用引物组和方法

说明书

本发明公开了基于七重PCR技术的肉类检测用引物组和方法，特点是包括骆驼特异性引物对、鸽子特异性引物对、鸡特异性引物对、鸭特异性引物对、马特异性引物对、牛肉特异性引物对和猪特异性引物对，其用于同时鉴别7种肉源食品的PCR检测方法，包括以下步骤1）样品DNA提取；2）根据骆驼细胞色素c氧化酶亚基Ⅲ、鸽子NADH脱氢酶6亚基、鸡D‑loop、鸭ATP酶6亚基、马NADH脱氢酶亚基4、牛肉细胞色素c氧化酶亚基Ⅱ和猪16SrRNA基因序列分别设计物种特异性引物；3）多重PCR反应的建立；4）进行琼脂糖凝胶电泳检测判断是否掺杂以及掺杂的肉类，优点是操作简单、灵敏度高和特异性好。

技术领域

本发明属于食品质量安全检测技术领域，尤其是涉及一种基于七重PCR技术的肉类检测用引物组和方法。

背景技术

肉类掺假是国内外普遍存在的食品安全问题，近年来更是成为一个重要的全球性问题，受到了国际社会的广泛关注。如今，掺假的技术手段日新月异，掺伪制品能够在 其形态和物理特征等方面最大程度地接近纯肉，单靠肉眼观察和感官评价已很难做到区 分。频繁的肉制品掺伪事件可能危及食品安全，违反市场规则，甚至威胁公共健康，造 成严重的食品安全事故。因此，一种具有快速、灵敏、准确识别动物来源的实用技术的 开发具有重要意义。

近年来，随着分子生物学发展，识别肉类物种来源的技术不断发展。DNA分子存在于每个细胞中，具有极高的稳定性，能够耐受高温、高压及化学方法等处理。因此，基于DNA水平的技术手段结合聚合酶链式反应(PCR)的分子诊断是更为可靠的分析方法。目前，多重PCR和实时荧光定量PCR(RT-PCR)技术都被认为是具有高灵敏度和特异性的可靠方法。RT-PCR能够提供掺杂肉含量的定量分析，然而精准的定量取决于合适的内参，对于多样化肉种类的掺杂，这一要求极大限制RT-PCR分析的准确度，而且RT-PCR需要专业仪器设备和专业技能操作。相比之下，多重PCR借助简单的琼脂糖凝胶电泳实验，能够直观判断较多种类肉的掺杂。由于肉类物种具有高度的同源性，靶基因的选择对于多重PCR系统的构建至关重要。动物细胞中线粒体DNA序列具有种内和种间多态性的可变区，非常适合近缘动物物种的区分。此外，线粒体DNA序列在环状结构内具有多个拷贝，在肉类加工过程中更加稳定。因此，可以选择线粒体序列的多态性位点作为设计肉源中物种特异性引物的靶区。由于多重PCR法可以同时检测到多个靶点，故需要对物种特异性引物进行分析、筛选和优化，以消除动物物种间的相互，从而排除肉源间的交叉反应。因此，基于线粒体DNA序列，建立快速、准确、敏感的多重PCR肉源检测技术是严格监测市场上肉制品安全的基础和关键之一。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种操作简单、灵敏度高和特异性好的基于七重PCR技术的肉类检测用引物组和方法。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：

1、一种基于七重PCR技术的肉类检测用引物组，包括骆驼特异性引物对、鸽子特异性引物对、鸡特异性引物对、鸭特异性引物对、马特异性引物对、牛特异性引物对和猪特异性引物对，

其中，骆驼的特异性引物对序列为：

上游引物：5’-GCTCCACTTTCCTAACCGTGT- 3’，

下游引物：5’-ATAGAGGAACAGCCAGACGACA- 3’；

鸽子的特异性引物对序列为：

上游引物：5’-CACCGCCCGAATCGCACCAC- 3’，

下游引物：5’-AGGGATGTTTTCTGTCCGGTT- 3’；

鸡的特异性引物对序列为：

上游引物：5’-CCCTACTTGCCTTCCACCGTA- 3’，

下游引物：5’-CTTGAATAGCACTCCGCACCC- 3’；

鸭的特异性引物对序列为：

上游引物：5’-TCCCAGCCCTATTGTTCCCAT- 3’，