[发明专利]基于七重PCR技术的肉类检测用引物组和方法

权利要求书

1.一种基于七重PCR技术的肉类检测用引物组，其特征在于包括骆驼特异性引物对、鸽子特异性引物对、鸡特异性引物对、鸭特异性引物对、马特异性引物对、牛特异性引物对和猪特异性引物对，

其中，骆驼的特异性引物对序列为：

上游引物：5’-GCTCCACTTTCCTAACCGTGT- 3’，

下游引物：5’-ATAGAGGAACAGCCAGACGACA- 3’；

鸽子的特异性引物对序列为：

上游引物：5’-CACCGCCCGAATCGCACCAC- 3’，

下游引物：5’-AGGGATGTTTTCTGTCCGGTT- 3’；

鸡的特异性引物对序列为：

上游引物：5’-CCCTACTTGCCTTCCACCGTA- 3’，

下游引物：5’-CTTGAATAGCACTCCGCACCC- 3’；

鸭的特异性引物对序列为：

上游引物：5’-TCCCAGCCCTATTGTTCCCAT- 3’，

下游引物：5’-TGTTAGTAGGGTAGCAAGCCACA- 3’；

马的特异性引物对序列为：

上游引物：5’-TAGAAGCCCCAATTGCCGGAT- 3’，

下游引物：5’-TATTGATGATGTAAGGCCGTGAG- 3’；

牛的特异性引物对序列为：

上游引物：5’-GCTGACCCATACAAGCACGA- 3’，

下游引物：5’-CGTAATATAAGCCTGGACGGGAC- 3’；

猪的特异性引物对序列为：

上游引物：5’-GAAGCCTTTCTCCTCGCACAC- 3’，

下游引物：5’-CCCAACCGAAATTGCTAGTCCA- 3’。

2.一种用于同时鉴别7种肉源食品的多重PCR检测方法，其特征在于包括步骤如下：

步骤一、样品DNA提取：

根据基因组DNA试剂盒说明书从肉类样本中分离基因组DNA，并测DNA浓度；

步骤二、种特异性引物设计：根据骆驼细胞色素c氧化酶亚基Ⅲ序列、鸽子NADH脱氢酶6亚基、鸡D-loop、鸭ATP酶6亚基、马NADH脱氢酶亚基4、牛细胞色素c氧化酶亚基Ⅱ和猪16SrRNA基因基因序列分别设计物种特异性引物：

其中，猪的特异性引物对序列为：

上游引物：5’-GAAGCCTTTCTCCTCGCACAC- 3’，

下游引物：5’-CCCAACCGAAATTGCTAGTCCA- 3’；

牛的特异性引物对序列为：

上游引物：5’-GCTGACCCATACAAGCACGA- 3’，

下游引物：5’-CGTAATATAAGCCTGGACGGGAC- 3’；

马的特异性引物对序列为：

上游引物：5’-TAGAAGCCCCAATTGCCGGAT- 3’，

下游引物：5’-TATTGATGATGTAAGGCCGTGAG- 3’；

鸭的特异性引物对序列为：

上游引物：5’-TCCCAGCCCTATTGTTCCCAT- 3’，

下游引物：5’-TGTTAGTAGGGTAGCAAGCCACA- 3’；

鸡的特异性引物对序列为：

上游引物：5’-CCCTACTTGCCTTCCACCGTA- 3’，

下游引物：5’-CTTGAATAGCACTCCGCACCC- 3’；

鸽的特异性引物对序列为：

上游引物：5’-CACCGCCCGAATCGCACCAC- 3’，

下游引物：5’-AGGGATGTTTTCTGTCCGGTT- 3’；

骆驼的特异性引物对序列为：

上游引物：5’-GCTCCACTTTCCTAACCGTGT- 3’，

下游引物：5’-ATAGAGGAACAGCCAGACGACA- 3’；

步骤三、七重PCR反应条件建立

PCR反应系统由10×EasyTaq®缓冲液2.5μL，2.5mM dNTPs 2μL， EasyTaq DNA聚合酶0.5μL，各混合物种mM上下游引物各0.5μL，每个物种的基因组DNA 0.01-10 ng，并用ddH2O补充体系至25μL；94℃下变性5min，然后在94℃30s，63℃30s，72℃45s下进行34个循环，最后在72℃下延伸5min；

步骤四、琼脂糖凝胶电泳进行结果分析

PCR片段扩增结束，用质量浓度为4%琼脂糖凝胶分析，并在凝胶成像系统中拍照，根据胶图条带即可判断样品是否有杂肉掺入。