[发明专利]一种修饰细胞外囊泡的试剂及制备方法

说明书

本发明公开一种修饰细胞外囊泡的试剂及制备方法，将叠氮化修饰的修饰物与经过羧基活化的二苯环辛炔酸进行点击化学偶联，形成同时具备修饰物功能基团与活性酯基团的修饰细胞外囊泡的试剂。本发明有益效果是：不改变细胞外囊泡的形态学及结构组成，也不影响细胞外囊泡的生物学功能，能够稳定、高效且可控地修饰细胞外囊泡；例如，修饰物为荧光探针时，能够高效可控地对细胞外囊泡进行修饰，取得了良好的细胞外囊泡的可视化效果，能够为开发细胞外囊泡活体示踪方法及细胞外囊泡示踪药物提供新策略。

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其是涉及一种修饰细胞外囊泡的试剂及制备方法。

背景技术

细胞外囊泡(Extracellular Vesicle, EV)是一类由多种活细胞分泌并释放，直径在30-1000 nm范围且具备脂质双分子层结构的囊泡状小体。细胞外囊泡广泛存在于细胞培养上清液以及大多数动物的各种体液(如乳汁、血液、尿液与淋巴液等)中，含有的细胞特异的蛋白和核酸能作为信号分子传递给其他细胞从而改变其他细胞的功能，以及其脂双层结构稳定的包裹作用与可靶向性修饰等优势，使得细胞外囊泡已经成为近年来靶向药物递送系统领域的研究热点。目前，已有越来越多的研究表明，细胞外囊泡是一种具备良好的稳定性、出色的生物相容性及固有的长期循环能力的新型内源性药物载体，适合于递送各种小分子化学药，蛋白质，核酸和基因治疗剂。如间充质干细胞来源的细胞外囊泡装载紫杉醇后对人胰腺癌细胞显示出显著的抗增值活性。但目前能够用于细胞外囊泡装载及递送的药物种类有限，主要以小分子化学药为主。多肽、蛋白分子以及核酸类药物因自身结构复杂，对细胞外囊泡装载的要求较高，因此多采用细胞外囊泡包覆的形式装载，极少通过化学偶联的方式载药。以药物包覆的方式为主的细胞外囊泡载药方法大多存在载药率低、载药稳定性差、药物递送效果不理想以及操作繁琐等弊端。

此外，细胞外囊泡的体内外示踪是使用细胞外囊泡作为药物载体进行疾病治疗的前提与关键。迄今为止，大多数细胞外囊泡示踪标记方法均在一定程度上会改变细胞外囊泡的形态学及膜结构组成，影响其理化性质及生物学功能。例如CD9是细胞外囊泡常见的表面标志物之一，具有重要的功能。将带有羧基的荧光分子与CD9蛋白上的氨基通过酯化交联标记细胞外囊泡，结果显示CD9的表达水平下调，说明标记后的细胞外囊泡的膜组成已发生改变。因此该方法影响了细胞外囊泡正常的生物学功能。而使用常规膜染料对细胞外囊泡脂膜标记的方法存在染料易淬灭、标记效率低以及改变膜结构等缺陷。此外，目前的细胞外囊泡示踪标记方法还存在技术不成熟及可重复性低等不足。这些问题严重阻碍了对细胞外囊泡可视化研究的进程。因此，亟需一种稳定可靠的细胞外囊泡修饰方法，在不影响细胞外囊泡形态、结构及生物学功能的条件下通过偶联荧光分子实现细胞外囊泡的可视化，并在此基础上对细胞外囊泡的生物学功能及治疗作用做进一步研究。还可通过该细胞外囊泡修饰方法，将小分子化学药、多肽、蛋白分子或核酸大分子等药物与细胞外囊泡偶联，实现细胞外囊泡药物装载及递送。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种修饰细胞外囊泡的试剂及制备方法。

本发明采用的技术方案是：一种化合物，结构如式2所示；

式2；

其中，n≤14且n为偶数，R为修饰物。

优选地，修饰物为小分子化合物或大分子化合物；

优选地，小分子化合物为荧光探针或化学药物；大分子化合物为核酸片段、多肽或蛋白分子。

制备式2化合物的方法，叠氮化修饰修饰物，与经过羧基活化的二苯环辛炔酸点击化学偶联，形成修饰细胞外囊泡的试剂。

优选地，碳二亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺组成的交联剂活化二苯环辛炔酸的羧基，获得二苯环辛炔琥珀酰亚胺酯。

优选地，碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺和二苯环辛炔酸的摩尔比为1-1.1:1-1.3:1。