[发明专利]一种建立农杆菌介导中国水仙高效遗传转化体系的方法

说明书

本发明公开了一种建立农杆菌介导中国水仙高效遗传转化体系的方法，包括以下步骤：植物材料预处理、外植体消毒、愈伤组织诱导、侵染液制备、农杆菌侵染、共培养和筛选培养以及GUS染色检测。本发明以中国水仙子房为转化材料，通过农杆菌类型和愈伤组织预培养时间及卡那霉素浓度的优化，建立了中国水仙的高效遗传转化体系，且转化效率高，为中国水仙种植资源创制及品种改良奠定了基础。

技术领域

本发明涉及生物技术领域的中国水仙遗传转化方法，具体涉及一种诱导子房产生的愈伤组织为受体，建立农杆菌介导的中国水仙高效遗传转化体系的方法。

背景技术

中国水仙（Narcissus tazetta var. chinensis）是石蒜科多年生球根植物，主要栽培区为福建漳州、上海崇明、浙江舟山，是中国传统十大名花之一。其因花形态优美、花香淡雅、适应性强、易于雕刻等特点，颇具观赏价值；但其花色单一，花期较短，限制了水仙花产业的发展。改良水仙花色和延长花期一直以来都是广大园艺育种学家的重点研究目标之一。目前，国内外对中国水仙诱导愈伤组织体系的研究较为深入，但现有遗传转化体系受到基因型的限制多数只能瞬时表达，稳定遗传转化阳性率极低，因此，需要在前人的基础上进行试验摸索其适宜的遗传转化体系。

农杆菌Ti质粒可以携带外源基因通过同源重组插入植物基因组，且具有拷贝数固定、后代稳定遗传简单等优点。因此在植物转基因方面，农杆菌介导法常被采用。中国水仙因其品种少，野生资源匮乏，同源三倍体有性杂交育种困难，因此通过基因工程，来改善花期、花色、花香、花形等性状的育种手段可行性较强，应用价值高。目前有关建立高效中国水仙的遗传转化体系的研究普遍存在转化效率低、不能稳定遗传、再生能力差等问题。本发明拟解决上述问题，为进一步从中培育花期长、花香浓郁、花色丰富的水仙花新品种奠定基础。

发明内容

针对已有技术的不足，本发明的目的在于提供一种建立农杆菌介导中国水仙高效遗传转化体系的方法。

为了实现上述目的，本发明采取如下技术解决方案：

一种建立农杆菌介导中国水仙高效遗传转化体系的方法，所述方法包括以下步骤：

（1）种球预处理：将三年生的中国水仙种球放置于4 ℃避光冷藏4星期；

（2）外植体消毒：完整的花葶进行消毒处理后取出完整的子房；

（3）愈伤组织诱导：子房切成小块，放置于Z1预培养培养基上，于温度25±2 ℃、光周期16 h/d、光照强度50 µmol m^-2s^-1的条件下培养60d ；

（4）侵染液的制备：取2 μL OD₆₀₀=0.8的单克隆农杆菌菌液转接至2 mL YEP液体培养基中，于28 ℃、200 rpm振荡培养36-48 h后取20μL菌液转接至20 mL YEP液体培养基中，于28 ℃、200 rpm振荡过夜培养直到OD₆₀₀达到0.8，离心收集菌体，并用1/2MS培养基冲洗菌体以除去残余YEP液体培养基，再用含100 µM乙酰丁香酮的1/2MS培养基重悬菌体使得菌悬液OD₆₀₀达到0.4-0.5，菌悬液于140 rpm、28 ℃条件下振荡2-4 h，得到侵染液；

（5）侵染：将诱导得到的长势良好的愈伤组织，浸没到侵染液中，于室温、20 0rpm条件下振荡20 min；

（6）共培养：结束侵染后，取出愈伤组织铺在无菌滤纸上，晾干后将愈伤组织夹到Z1液体培养基浸润的滤纸上，28 ℃黑暗共培养3 d；