[发明专利]一种建立农杆菌介导中国水仙高效遗传转化体系的方法

权利要求书

1.一种建立农杆菌介导中国水仙高效遗传转化体系的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：

（1）种球预处理：将三年生的中国水仙种球放置于4℃避光冷藏4星期；

（2）外植体消毒：完整的花葶进行消毒处理后取出完整的子房；

（3）愈伤组织诱导：子房切成小块，放置于Z1预培养培养基上，于温度25±2℃、光周期16h/d、光照强度50μmol·m^-2·s^-1的条件下培养60d；

（4）侵染液的制备：取2μL OD₆₀₀=0.8的单克隆农杆菌菌液转接至2mL YEP液体培养基中，于28℃、200rpm振荡培养36-48h后取20μL菌液转接至20mL YEP液体培养基中，于28℃、200rpm振荡过夜培养直到OD₆₀₀达到0.8，离心收集菌体，并用1/2MS培养基冲洗菌体以除去残余YEP液体培养基，再用含100µM乙酰丁香酮的1/2MS培养基重悬菌体使得菌悬液OD₆₀₀达到0.4-0.5，菌悬液于140rpm、28℃条件下振荡2-4h，得到侵染液；

（5）侵染：将诱导得到的长势良好的愈伤组织，浸没到侵染液中，于室温、200rpm条件下振荡20min；

（6）共培养：结束侵染后，取出愈伤组织铺在无菌滤纸上，晾干后将愈伤组织夹到Z1液体培养基浸润的滤纸上，28℃黑暗共培养3d；

（7）共培养结束与筛选：3d共培养结束后，用ddH₂O冲洗愈伤组织5次，再用Z1液体培养基冲洗一次，铺在无菌滤纸上晾干，再转接至R1再生培养基于温度25±2℃、光周期16h/d、光照强度50μmol·m^-2·s^-1的条件下培养30d，期间每20天继代一次，得到抗性愈伤组织；

（8）得到的抗性愈伤组织采用GUS染色检测，有蓝色显色反应的抗性愈伤组织认定为阳性愈伤组织，表明中国水仙遗传转化成功；

其中，所述的消毒方法为：完整的花葶用1g/L的多菌灵溶液浸泡15min，再用体积分数75%的乙醇溶液浸泡1min，再用质量分数1%的NaClO和质量分数0.1%的Tween-20的混合溶液浸泡8min，再用无菌水冲洗5次，每次30s；

所述的Z1预培养培养基以MS培养基为基础培养基，并添加了9mg/L的6-苄氨基嘌呤、3mg/L的1-萘乙酸、0.16g/L的硫酸腺嘌呤和30g/L的蔗糖；

所述的农杆菌为EHA105农杆菌，其含植物表达载体pGWB344，且携带有抗卡那霉素基因和报告基因GUS；

所述的Z1液体培养基以MS培养基为基本培养基，并添加了400mg/L的头孢霉素和50mg/L的卡那霉素；

所述的ddH₂O中含有400mg/L的头孢霉素和50mg/L的卡那霉素；

所述的YEP液体培养基中含有50mg/L的壮观霉素及100mg/L的利福平；

所述的R1再生培养基以MS培养基为基础培养基，并添加了3mg/L的6-苄氨基嘌呤、9mg/L的1-萘乙酸、0.16g/L的硫酸腺嘌呤、30g/L的蔗糖以及50mg/L的卡那霉素。

2.如权利要求1所述的一种建立农杆菌介导中国水仙高效遗传转化体系的方法在水仙育种中的应用。