[发明专利]同步鉴别食品中多种动物源性成分的多重RT-PCR预混试剂冻干球及其制备方法与应用

说明书

本发明涉及生物技术领域，具体公开了同步鉴别食品中多种动物源性成分的多重RT‑PCR预混试剂冻干球及其制备方法与应用。本发明的制备多重RT‑PCR预混试剂冻干球的方法，其中，所述冻干球包括多重荧光PCR反应体系和保护剂，所述多重荧光PCR反应体系包含5对特异性引物组合，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1‑10所示，所述保护剂包括聚乙二醇8000、Triton X‑100、甘露醇和海藻糖。本发明方法制备的多重RT‑PCR冻干球，可常温运输和储存，能用于鉴别肉或肉制品中是否含有猪、牛、绵羊、山羊、鸡、鸭、狗、狐、貉9种动物源性成分。具有检测准确，操作简便快速高效的优点。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及同步鉴别食品中多种动物源性成分的多重RT-PCR预混试剂冻干球及其制备方法与应用。

背景技术

由于肉类掺假的情况屡见不鲜，不仅侵害了消费者利益，也会对整个肉类产业造成巨大影响，因此需要可靠的肉类快速真伪鉴别技术，作为相关部门对肉类食品安全进行监管的重要检测手段。

多重实时荧光PCR技术应用在物种鉴别领域，具有特异性强、灵敏准确、高通量和低成本的优点。但由于实时荧光PCR反应体系中的核心组分Taq酶的活性对温度较为敏感，且荧光染料需要避光等诸多因素，因此这一类试剂在保存和运输条件上的要求十分苛刻。液体状态的试剂只能低温避光保存以避免其性状发生变化从而影响使用效果。其次，目前市面上应用于物种检测的荧光PCR产品多为各个组分独立封装的液体试剂盒形式，除了运输和保存的弊端外，在使用时需要人工配制反应液，操作繁琐且增加了误差和错误率。

液体试剂经过冷冻干燥排除95%~99%的水分后，能够有效延长保存期。但由于多重PCR反应体系对酶稳定性要求极其苛刻，使用常规的冻干保护剂和通用的冷冻干燥流程对多重PCR反应体系进行冻干后依旧会导致多个扩增产物间比例发生巨大变化，致使检测方法失去原有效果。因此，为将PCR反应试剂在冻干过程中热敏性酶发生变性或失活的幅度降到最低，且保证其他组分如引物、dNTP、荧光染料在冻干前后具有相同的效力，仍需要进行进一步研究。

发明内容

本发明的目的是为了弥补现有肉类鉴别技术的不足，提供一种可同步、快速鉴别肉或肉制品中猪、牛、绵羊、山羊、鸡、鸭、狗、狐、貉9种源性成分的多重荧光PCR预混试剂冻干球及其制备方法与应用。

为了实现该目的，本发明的技术方案如下：

一种制备多重RT-PCR预混试剂冻干球的方法，所述冻干球包括多重荧光PCR反应体系和保护剂，所述多重荧光PCR反应体系包含5对特异性引物组合，其核苷酸序列如SEQID NO.1-10所示，所述保护剂包括聚乙二醇8000、Triton X-100、甘露醇和海藻糖。

本发明的冻干球含有以猪、牛、绵羊、山羊、鸡、鸭、狗、狐、貉的线粒体DNA为靶序列分别设计的5对特异性引物：羊F/羊R、牛F/牛R、狗狐貉F/狗狐貉R、猪F/猪R、鸡鸭F/鸡鸭R，其中，羊F/羊R可同时扩增绵羊和山羊源性成分；狗狐貉F/狗狐貉R可同时扩增狗源性、狐源性和貉源性成分；鸡鸭F/鸡鸭R可同时扩增鸡源性和鸭源性成分。应用本发明提供的上述引物组合，以待测肉或肉制品的DNA为模板，使用多重荧光PCR方法进行检测时，各特异性引物扩增产物的Tm值具有显著差异，可通过熔解曲线峰图谱（峰的个数和Tm值）分析进行鉴别。各特异性引物序列如下：

对绵羊、山羊源性成分扩增时所需的特异性引物为：

羊F：5'- AACAAAGCGCCTTAAACCAATT -3'（SEQ ID NO.1）

羊R：5'-CCTTTTCTAGGGCAGGTTTTGT -3'（SEQ ID NO.2）；

对牛源性成分扩增时所需的特异性引物为：

牛F：5'- GTTCTTCACGACACATACTACGTT -3'（SEQ ID NO.3）