[发明专利]同步鉴别食品中多种动物源性成分的多重RT-PCR预混试剂冻干球及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种制备多重RT-PCR预混试剂冻干球的方法，其特征在于，所述冻干球包括多重荧光PCR反应体系和保护剂，所述多重荧光PCR反应体系包含5对特异性引物组合，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1-10所示；

所述保护剂由如下组分组成：20.1wt%聚乙二醇8000、1.8wt% Triton X-100、6.15wt%甘露醇、6.15wt%海藻糖，余量为水；

每20μL所述多重荧光PCR反应体系包含：SYBR Green Ⅰ Master预混液10μL，SEQ IDNO.1-2所示的引物各2.9pmol、SEQ ID NO.3-4所示的引物各4.35pmol、SEQ ID NO.5-6所示的引物各6.35pmol、SEQ ID NO.7-8所示的引物各2.4pmol、SEQ ID NO.9-10所示的引物各3.4pmol，其余体积用ddH₂O补足；

所述方法包括将所述多重荧光PCR反应体系与所述保护剂混合后，先滴入液氮再进行冷冻干燥的步骤；所述冷冻干燥的工艺顺序依次为：预冻-40℃，0.5h；主干燥-40℃，0.1mbar，0.5h；-35℃，0.1mbar，2h；-30℃，0.1mbar，10h；0℃，0.1mbar，2h；20℃，0.05mbar，2h；终末干燥30℃，0.01mbar，3h；

所述多重荧光PCR反应体系与所述保护剂的体积比为1：0.2。

2.一种多重RT-PCR预混试剂冻干球，其特征在于，通过权利要求1所述的方法制备得到。

3.权利要求2所述的冻干球在同步鉴别肉或肉制品中多种动物源性成分中的应用，所述动物源性成分为猪、牛、绵羊、山羊、鸡、鸭、狗、狐和貉。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，应用时，以待测肉或肉制品的DNA和复溶后的所述冻干球的混合物为待测物，使用RT-PCR方法进行检测，以荧光信号对温度的一阶负导数为纵坐标，温度为横坐标，得到熔解曲线峰值图，根据熔解曲线峰值图中峰的个数和位置判定结果；

每一种特异性扩增产物峰代表一种特定的动物源性成分，其中，Tm值在71.1~73.7 ℃范围内出现的熔解曲线峰为绵羊或山羊源性成分检出；Tm值在74.0~75.4 ℃范围内出现的熔解曲线峰为牛源性成分检出；Tm值在76.2~78.1 ℃范围内出现的熔解曲线峰为狗或狐狸或貉源性成分检出；Tm值在80.3~81.2 ℃范围内出现的熔解曲线峰为猪源性成分检出；Tm值在84.7~87.5 ℃范围内出现的熔解曲线峰为鸡或鸭源性成分检出。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，RT-PCR反应条件为：（1）预变性：95℃，5min；（2）变性：95℃，15 s； 退火+延伸：57℃，45 s，30个循环；（3）熔解曲线：95℃，1min；70℃，1min；以0.02℃/s速率升温至95℃，同时连续检测荧光强度；降温至40℃，1min。