[发明专利]大鼠细小病毒RPV-1特异性VP2基因重组抗原、合成方法及试剂盒

权利要求书

1.一种大鼠细小病毒RPV-1特异性VP2基因重组抗原，其特征在于：其氨基酸序列为SEQID NO：1。

2.一种大鼠细小病毒的间接ELISA试剂盒，其特征在于：包含有权利要求1中所述的大鼠细小病毒RPV-1特异性VP2基因重组抗原。

3.一种大鼠细小病毒的免疫学试剂盒，其特征在于：包含有权利要求1中所述的大鼠细小病毒RPV-1特异性VP2基因重组抗原。

4.一种大鼠细小病毒RPV-1重组蛋白的合成方法，其特征在于：其包括以下步骤：

S1、RPV重组质粒的构建；根据大鼠细小病毒RPV-1特异性VP2蛋白序列，选取201aa-450aa片段，将蛋白序列相应的核酸序列按照大肠杆菌密码子的偏好性进行优化，人工合成优化后的核酸序列，同时在羧基端加6*His标签序列后拼接至pET28a载体，pET28a载体自带有6*His标签，构建重组质粒pET28a-VP2；将pET28a-VP2重组质粒转化至DH5a感受态细胞，在含有50 μg/mL卡那霉素的LB固体培养基，37℃培养过夜；挑取单菌落接种于3 mL含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，在恒温振荡培养箱37℃、180 rpm培养过夜，用高纯度质粒小提试剂盒制备质粒，将质粒送至测序公司测序，测序结果证明与理论预期一致，在-20℃下保存备用；

S2、重组蛋白pET28a-VP2的表达；将保存的质粒转化至BL21(DE3)感受态细胞，在含有50 μg/mL卡那霉素的LB固体培养基，37℃培养过夜；挑取单菌落接种于3 mL含有50 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，在恒温振荡培养箱37℃、180 rpm培养过夜，再转接至900 mL含有50 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，37℃、180 rpm振荡培养，当OD₆₀₀到0.8左右时加入终浓度0.5mM异丙基硫代半乳糖苷IPTG,诱导培养5小时，收集菌体；

S3、重组蛋白pET28a-VP2的纯化；在4℃，4000rpm离心10分钟收集菌体，菌体用缓冲液重悬；重悬液在冰水浴中以300w超声破碎细胞，4℃ 4000rpm离心10min取上清；上清用0.45μm滤膜过滤后，经HisTrap HP纯化，得到纯化的重组蛋白6*His-VP2-6*His；

S4、重组蛋白pET28a-VP2的透析与浓缩；将纯化产物加入到已用蒸馏水充分冲洗后的3.5kD Spectra 透析袋，在4℃下透析至透析缓冲液，纯化产物与透析液体积比为1:100，换液2次，共透析24 h；透析后的纯化产物用超滤管进行浓缩；浓缩后产物用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，将浓缩后产物分装，并在-80℃下保存。

5.根据权利要求4所述的大鼠细小病毒RPV-1重组蛋白的合成方法，其特征在于：还包括步骤S5，重组蛋白pET28a-VP2的SDS-PAGE鉴定；取15μL重组蛋白加入2×LoadingBuffer15 μL，混合后煮沸5min，瞬离后取上清20 μL上样到10% SurePAGE；用Bio-Rad电泳仪，110V电泳1h；凝胶用考马斯亮蓝染色液浸没并在水平摇床上低速转动，室温染色2h；去除染色液，加入脱色液浸没凝胶并在水平摇床上低速转动，30min更换一次新的脱色液，脱色至条带清晰且背景无蓝色，脱色后的凝胶在凝胶成像系统中拍照记录。