[发明专利]一种CAR细胞疗法用核酸构建体及其慢病毒载体、细胞制剂和应用

说明书

本发明公开了一种CAR细胞疗法用核酸构建体及其慢病毒载体、细胞制剂和应用，其中，一种CAR细胞疗法用核酸构建体，包括依次串连的信号肽、抗原结合区、胞外铰链区、跨膜结构域和胞内信号域，所述胞内信号域由DAP10CD、CD137CD和CD3ζSD所组成。一种慢病毒载体，包含CAR细胞疗法用核酸构建体的基因。一种细胞制剂，为导入有前述慢病毒载体的免疫效应细胞。一种细胞制剂在癌症治疗中的应用。本发明所制备出的细胞制剂相较于其他CAR结构构建的免疫细胞制剂具有较高的活性，尤其该类CAR结构修饰的NK细胞，对表达目标靶点肿瘤细胞(如表达Her‑2的乳腺癌细胞)具有极高的杀伤能力。

【技术领域】

本发明涉及细胞免疫治疗的技术领域，特别是一种CAR细胞疗法用核酸构建体及其慢病毒载体、细胞制剂和应用的技术领域。

【背景技术】

恶性肿瘤是危害人类健康的重大疾病之一。传统的肿瘤治疗方式，如手术、放疗和化疗，是近几十年来用于肿瘤治疗的主要策略。但是，病人容易对药物和放疗治疗产生抗性，致使高频率的肿瘤复发。近年来，肿瘤细胞治疗因其靶向性、效果显著和几无副作用等优点得到了极大关注，逐步成为肿瘤综合治疗中的一个重要手段，被业界称为肿瘤的绿色疗法，也是当前肿瘤治疗基础研究和临床应用的热点与发展方向。

肿瘤的嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor,CAR)疗法，指一种用嵌合抗原受体修饰的免疫细胞治疗肿瘤的新型精准靶向疗法，近几年通过优化改良在临床肿瘤治疗上取得了很好的效果，具有精准、快速和高效的特点，有可能治愈癌症，非常有前景。在通常情况下，肿瘤的嵌合抗原受体细胞疗法通过基因工程技术，将识别肿瘤的定位导航装置嵌合抗原受体转导入免疫细胞(如T细胞和NK细胞)，对应地重组为CAR-T细胞和CAR-NK细胞。CAR-T细胞和CAR-NK细胞能够利用其转导的CAR结构，专门识别体内肿瘤细胞后获得激活，通过免疫作用释放大量的多种效应因子，从而高效地杀灭肿瘤细胞，达到治疗恶性肿瘤的目的。

嵌合抗原受体通常由肿瘤相关抗原结合区、胞外铰链区、跨膜结构域以及包含或不包含共刺激结构域的细胞内信号传导结构域序贯串联组成。随着科学技术研究的持续推进，CARs至今已经发展到了第四代。其中，第一代CARs包含胞外单链可变片段scFv、跨膜区和单个胞内激活信号CD3ζ或FcεRIγ。第一代CAR-T细胞只能引起短暂的T细胞增殖和较少的细胞因子分泌，其体内抗肿瘤活性受到极大限制，并且T细胞增殖减少最终会导致T细胞的凋亡。第二代CARs在第一代CARs的基础上引入了一个共刺激分子，提高了肿瘤杀伤效力。在第三代CARs中，则搭载了多个共刺激因子，如CD28、CD134(OX40)和CD137(4-1BB)等。共刺激分子可以激活T细胞内的JNK、ERK和NF-κB等信号通路，使T细胞在抗肿瘤活性、增殖活性、存活周期和细胞因子(如IL-2、TNF-α和IFN-γ)的分泌延长等方面均产生显著提高。第四代CARs在第三代CARs的基础上增加了可选择性的标记及编码CARs扩增和自杀的启动子。

研究表明，CAR设计和内在特性也会影响CAR修饰免疫细胞的扩增和持久性。目前，包含CD3-ζ信号结构域和共刺激结构域(通常为CD28或4-1BB)的第二代CARs仍然是临床使用中最常见的核酸构建体。此外，研究发现，采用CD28作为共刺激分子时，T细胞虽然杀伤作用强但持续时间短，而采用4-1BB作为共刺激分子时，T细胞虽然持续时间长但杀伤能力有限。

因此，现有的嵌合抗原受体免疫细胞疗法在用于肿瘤治疗上仍有许多不尽理想之处。例如CAR-T细胞治疗过程中会出现多种不良反应，包括细胞因子释放综合征等。而且由于这些毒副反应的临床表现往往错综复杂，变化多端，进展迅速；而且每种CAR修饰细胞制品因为生产工艺或CAR结构的不同有着独特不同效应特征，有待进一步充分的认识及精确的评估。

【发明内容】