[发明专利]一种右旋糖酐磁珠模拟BoHV-1病毒粒子的制备与应用

说明书

本发明公开了一种右旋糖酐磁珠模拟BoHV‑1病毒粒子的制备，步骤如下：S1、合成牛疱疹病毒gB、gC、gD蛋白基因；S2、构建真核表达重组质粒；S3、真核表达质粒转染MDBK细胞；S5、真核表达蛋白纯；S7、右旋糖酐磁珠磁珠模拟BoHV‑1病毒粒子制备。本发明采用上述的一种右旋糖酐磁珠模拟BoHV‑1病毒粒子的制备与应用，通过将囊膜蛋白固定在右旋糖酐磁珠表面制备出粒径小，却具有近乎BoHV‑1完整抗原性的亚单位疫苗，同时通过PEG化还可以延长蛋白在体内的存在时间，来延长免疫反应持续期。

技术领域

本发明涉及疫苗制备技术领域，尤其是涉及一种右旋糖酐磁珠模拟BoHV-1病毒粒子的制备与应用。

背景技术

Ⅰ型牛疱疹病毒(BoHV-1)主要通过呼吸道、生殖道等粘膜系统感染、在体内躲过机体免疫系统，进入宿主细胞内复制增殖，进而在体内扩散，最终到达三叉神经节处定植。在机体免疫力低下时，再次反复感染，而引起发病和疾病传播。由此，开发通过呼吸道或者生殖道免疫的疫苗的同时，还需要开发通过粘膜系统进入体内引起体液和细胞免疫的疫苗，才能从根本上预防病毒。

目前，灭活疫苗、DNA疫苗、基因缺失疫苗、亚单位疫苗均不能达到以上目的。近年来，纳米材料为药物和疫苗递送研究提供了全新的设计思路。

发明内容

本发明的目的是提供一种右旋糖酐磁珠模拟BoHV-1病毒粒子的制备与应用，选定BoHV-1gB、gC和gD蛋白作为亚单位疫苗抗原，通过将囊膜蛋白固定在右旋糖酐磁珠表面制备出粒径小，却具有近乎BoHV-1完整抗原性的亚单位疫苗，同时通过PEG化还可以延长蛋白在体内的存在时间，来延长免疫反应持续期。

为实现上述目的，本发明提供了一种右旋糖酐磁珠模拟BoHV-1病毒粒子的制备，步骤如下：

S1、合成牛疱疹病毒gB、gC、gD蛋白基因

按照GeneBank公布的BoHV-1gB、gC、gD基因序列，合成各个基因后，在gB上游加入HindⅢ酶切位点，其下游加入AgeⅠ酶切位点，gC/gD上游加入KpnⅠ酶切位点，其下游加入BSTBⅠ酶切位点；

S2、构建真核表达重组质粒

合成基因与pcDNA4-Myc-his真核表达质粒双酶切后连接构建pcDNA4-gB-his/pcDNA4-gC-his/pcDNA4-gD-his真核表达质粒，真核表达质粒转化DH5α大肠杆菌感受态以后，挑菌纯化后大量培养使用英国biological tool无内毒素质粒大提试剂盒提取以上真核表达质粒；

S3、真核表达质粒转染MDBK细胞

用PEI磁珠质粒转染法将以上真核表达质粒转染MDBK细胞系；

S4、构建真核表达细胞系

转染48h后加入含有10％FBS和500μg/mL zeocine DMEM培养基37℃5％CO₂培养48h将未转染成功的细胞杀死；

S5、真核表达蛋白纯

收取细胞培养上清和转染成功MDBK细胞，MDBK细胞经超声破碎后，12000*g离心30分钟沉淀细胞碎片收取上清用于下步纯化；

S6、真核表达蛋白鉴定；

S7、右旋糖酐磁珠磁珠模拟BoHV-1病毒粒子制备。

优选的，步骤S3中，转染细胞系的操作如下：

A、贴壁转染

1)细胞按照传代步骤操作，10⁵个/mL铺6孔板贴壁铺满孔后开始转染；

2)DNA与PEI磁珠无菌混合后用无菌ddH₂O稀释5倍后备用；