[发明专利]一种右旋糖酐磁珠模拟BoHV-1病毒粒子的制备与应用

权利要求书

1.一种右旋糖酐磁珠模拟BoHV-1病毒粒子的制备，其特征在于，步骤如下：

S1、合成牛疱疹病毒gB、gC、gD蛋白基因

按照GeneBank公布的BoHV-1gB、gC、gD基因序列，合成各个基因后，在gB上游加入HindⅢ酶切位点，其下游加入AgeⅠ酶切位点，gC/gD上游加入KpnⅠ酶切位点，其下游加入BSTBⅠ酶切位点；

S2、构建真核表达重组质粒

合成基因与pcDNA4-Myc-his真核表达质粒双酶切后连接构建pcDNA4-gB-his/pcDNA4-gC-his/pcDNA4-gD-his真核表达质粒，真核表达质粒转化DH5α大肠杆菌感受态以后，挑菌纯化后大量培养使用英国biological tool无内毒素质粒大提试剂盒提取以上真核表达质粒；

S3、真核表达质粒转染MDBK细胞

用PEI磁珠质粒转染法将以上真核表达质粒转染MDBK细胞系；

S4、构建真核表达细胞系

转染48h后加入含有10％FBS和500μg/mL zeocine DMEM培养基37℃5％CO₂培养48h将未转染成功的细胞杀死；

S5、真核表达蛋白纯

收取细胞培养上清和转染成功MDBK细胞，MDBK细胞经超声破碎后，12000×g离心30分钟沉淀细胞碎片收取上清用于下步纯化；

S6、真核表达蛋白鉴定；

S7、右旋糖酐磁珠磁珠模拟BoHV-1病毒粒子制备。

2.根据权利要求1所述的一种右旋糖酐磁珠模拟BoHV-1病毒粒子的制备，其特征在于，步骤S3中，转染细胞系的操作如下：

A、贴壁转染

1)细胞按照传代步骤操作，10⁵个/mL铺6孔板贴壁铺满孔后开始转染；

2)DNA与PEI磁珠无菌混合后用无菌ddH₂O稀释5倍后备用；

3)消化后细胞弃去原培养基，无菌PBS清洗2遍；

4)将2)步磁珠加入到3)步细胞中，37℃CO₂培养箱中培养20-30min；

5)加入正常的培养基继续培养，按正常传代操作进行；

B、悬浮转染

1)贴壁细胞消化后，300×g/min离心5min沉淀细胞弃掉培养基PBS清洗2遍在离心管中备用；

2)将DNA和磁珠按附表比例混合后，用无菌ddH₂O稀释5倍后备用；

3)将上步混合物加入细胞中吹打悬浮细胞；

4)上步混合物放入培养箱培养20-30min；

5)加入新鲜培养基转移到培养瓶或者培养皿中继续培养传代。

3.根据权利要求1所述的一种右旋糖酐磁珠模拟BoHV-1病毒粒子的制备，其特征在于，步骤S5中，用镍磁珠对his标签蛋白进行纯化步骤如下：

1)磁珠洗涤：将磁珠用磁铁吸附后加入适当体积2×bindingwash buffer洗涤2次，洗去磁珠保存液；

2)待纯化样品加入等体积的lysis buffer之后颠倒混匀；

3)磁珠颠倒混匀后取适量体积磁珠加入上一步样品中，颠倒混匀3min；

4)磁铁吸附磁珠，待磁珠吸附完全样品澄清后弃掉样品保留磁珠；

5)加入5mL 2×bindingwash buffer摇晃混匀后，磁铁再次吸附磁珠，重复3次弃液体；

6)将上一步残余液体用移液器吸干后加入his elution buffer 1mL浸泡磁珠2分钟后，磁铁吸附磁珠，收集液体放入另一个新的离心管中；

7)重复步骤5)两次后，5mL水保存磁珠。