[发明专利]一种靶向抗原同时外泌CD47抗体的免疫细胞及其应用

说明书

本发明公开了肿瘤免疫细胞治疗领域的一种靶向抗原同时外泌CD47抗体的免疫细胞及其应用。本发明一方面提供一种嵌合抗原受体，其由第一信号肽、抗原结合片段、铰链区、跨膜区、胞内共刺激信号域、胞内域、自剪切序列、第二信号肽和抗CD47单链抗体依次串联而成；另一方面提供一种靶向抗原同时外泌CD47抗体的免疫细胞，特别是嵌合抗原受体修饰的T细胞、NK细胞或NKT细胞。本发明将编码抗原结合片段的第一核酸和编码抗CD47单链抗体的第二核酸构建在同一个载体上，通过靶向抗原并外泌CD47抗体，可实现抗CD47抗体的局部递送，减轻对正常细胞的影响，并有效拮抗肿瘤免疫微环境中的免疫抑制因素，阻断肿瘤细胞的抗吞噬作用。

技术领域

本发明属于肿瘤免疫细胞治疗领域，具体涉及一种靶向抗原同时外泌CD47抗体的免疫细胞及其应用。

背景技术

作为一种新型靶向免疫疗法，嵌合抗原受体修饰的T细胞(CAR-T)已在血液系统恶性肿瘤疾病中展现出了卓越疗效。嵌合抗原受体(CARs)是将T细胞重新定位于肿瘤表面抗原的合成受体，主要由胞外抗原结合域、跨膜结构域和胞内结构域组成。胞外抗原结合域可特异性识别肿瘤抗原，并通过跨膜结构域连接胞内结构域，从而传递活化信号，促进T细胞的增殖与功能。经CAR修饰后的T细胞无须MHC分子的处理和递呈便可识别肿瘤细胞的肿瘤抗原，特异性杀伤肿瘤细胞，在临床上具有广阔的应用前景。第一代CARs通常将抗体衍生的肿瘤结合元件连接到CD3ζ或Fc受体信号结构域以触发T细胞活化，可在一定程度上杀伤肿瘤细胞，但效果并不十分理想，CART细胞存活时间较短。第二代和第三代治疗则增加了CD28、4-1BB等共刺激分子，在很大程度上延长了T细胞存活时间并增强其效应子功能。

在用化疗、放化疗联合以及造血干细胞移植等传统方式治疗难治复发白血病效果欠佳的情况下，CAR-T细胞治疗是理想选择。目前以CD19为靶点的CAR-T细胞在治疗难治复发白血病和淋巴瘤患者中的应用最为广泛，但病人在获得高缓解率的同时伴随着高复发率的风险。例如，CD19-CAR-T治疗难治复发非霍奇金淋巴瘤已取得显著疗效，约50％的患者可获得完全缓解，但其中约有55％在一年内复发；另外，由于免疫抑制性肿瘤微环境与抗原丢失等限制，与CD19-CAR-T在急性白血病中所取得的疗效相比，其在实体肿瘤中的疗效不佳。导致CD19-CAR-T治疗复发的主要机制包括抗原反复刺激导致的免疫抑制性肿瘤微环境和肿瘤选择性剪接导致的抗原逃逸。因此，为减少免疫抑制性TME对CAR-T细胞的抑制作用，减少治疗复发，需要进一步改善现有CD19-CAR-T细胞的结构与功能以及治疗策略，以期获得更好的疗效。

CD47是一种广泛分布于正常细胞表面的蛋白质，其主要配体SIRPα在巨噬细胞、粒细胞、单核细胞等髓样细胞的膜上高度表达。正常细胞表达CD47而标上自我标记，通过CD47/SIRPα轴释放“don’t eat me”信号，抑制巨噬细胞介导的吞噬作用，保护正常细胞免遭破坏。研究表明，CD47在多种肿瘤如白血病、淋巴瘤中均有高表达。通过高表达CD47，癌细胞可伪装成自身细胞释放抗吞噬信号，抑制巨噬细胞介导的吞噬作用，发生免疫逃逸，从而促进肿瘤的进展扩散，与肿瘤患者的预后不良相关。此外，CD47的表达与PD-1、Treg标记Foxp3、MDSC标记CD11b和CD33的表达正相关。抗CD47处理可促使肿瘤小鼠模型体内的巨噬细胞向M1亚型极化，并降低肿瘤小鼠模型的效应T细胞中PD-1的表达并增加IFN-γ的分泌，减少免疫抑制性细胞Tregs和MDSCs的数量，以此改善肿瘤微环境，延缓肿瘤的生长。但是抗CD47单链抗体的自身特性导致其应用具有一定局限性，且存在靶向正常细胞的风险，造成细胞毒性反应。

发明内容

为了解决现有技术中的不足，本发明的目的在于提供一种靶向抗原同时外泌CD47抗体的免疫细胞及其应用。

本发明第一方面提供一种嵌合抗原受体，由第一信号肽、抗原结合片段、铰链区、跨膜区、胞内共刺激信号域、胞内域、自剪切序列、第二信号肽和抗CD47单链抗体依次串联而成。

进一步地，所述抗原结合片段识别和结合的抗原为肿瘤相关抗原；