[发明专利]一种基于体细胞胚途径的独蒜兰组织快繁方法

说明书

一种基于体细胞胚途径的独蒜兰组织快繁方法，属于组培扩繁技术领域。采用开花结果后的1~3个月的独蒜兰果荚内壁组织为外植体，以B5培养基为初代培养基，诱导形成愈伤组织，并继续培养形成绿色丛生芽，后采用MS作为继代培养基进行增殖扩繁，绿色丛生芽在形态上进一步分化形成原球茎丛，原球茎直径超过0.5cm时采用1/2MS生根培养基诱导生根，生根良好的健壮瓶苗移栽到基质中进行驯化、栽培，最终形成的独蒜兰种苗。上述一种独蒜兰组培快繁方法，可以解决无法从叶片、假鳞茎和根尖等植株组织诱导生成愈伤组织，并进一步组培扩繁独蒜兰健康种苗的难题，可以快速、批量扩繁独蒜兰。

技术领域

本发明属于组培扩繁技术领域，尤其是涉及一种基于体细胞胚途径的独蒜兰组织快繁方法。

背景技术

独蒜兰[Pleione bulbocodioides (Franch.)Rolfe]是兰科独蒜兰属多年生草本植物，独蒜兰属约有20种，中国分布有16种，其中独蒜兰和云南独蒜兰俗称冰球子，和毛慈菇杜鹃兰一起合称为山慈菇，是传统名贵中药材，有清热解毒、化痰散结之效，主要用于治疗臃肿疗毒、瘰疬痰核、蛇虫咬伤等。独蒜兰花型美观，有较高的观赏价值，同时又有极高的药用价值，有较大的市场需求。随着对独蒜兰的深入研究和新产品的开发，市场对独蒜兰的需求不断增大，长期以来，独蒜兰都依靠采挖野生资源满足市场需求，但是人们无节制的采挖和野生环境的破坏，独蒜兰野生资源急剧减少，种质资源生物多样性遭到严重的破坏。独蒜兰果实为蒴果，透水透气性较差，同时独蒜兰种子细小、无胚乳，种子没有贮藏足够的营养物质供其萌发，在自然条件下很难萌发成苗，其有性繁殖率较低，且独蒜兰生长周期长，以种子繁殖到开花结实需要4～5年。因此，独蒜兰种群数量在自然条件下增殖很慢，群落更新能力弱，很难对人为造成的破坏进行恢复。近年来随着野生资源的减少和市场需求的上升以及人们对野生资源保护意识的觉醒，开始对独蒜兰进行人工种植。目前，独蒜兰的繁殖主要是依靠假鳞茎进行无性繁殖，每年增殖2～3倍，繁殖系数较低。植物组织培养通过提供合适的营养物质和环境条件，以植物组织为材料，能快速有效地培育新的植株，实现独蒜兰种质资源快速繁殖。

植物组织培养的理论依据是植物细胞的全能性和植物的再生理论，植物不同组织分化程度不同，其脱分化恢复分裂的能力和形成愈伤组织的再分化能力也不同。因此，在组织培养中，选择合适的外植体是试验能否成功的关键因素。陈之林等人对白花独蒜兰进行了组培快繁研究, 以种子和原球茎为外植体成功获得了组培苗。屈云慧等人以二叶独蒜兰的种子为外植体成功获得了组培苗。易瑾等人利用疣鞘独蒜兰和岩生独蒜兰的种子成功获得了组培苗。张燕等以独蒜兰种子、组培苗的原球茎和叶片为材料进行培养，发现以种子和原球茎为外植体能培养出新的植株，而以叶片为材料则不能得到新的组培苗。吴丽芳等对滇独蒜兰的种子、假鳞茎和叶片进行组织培养，结果表明种子通过培养能得到组培苗，而以假鳞茎和叶片为外植体均未获得组培苗。黄成林等以独蒜兰种子、假鳞茎和假鳞茎细胞悬浮液为材料进行培养，发现假鳞茎培养后虽然能产生愈伤组织增殖小原球茎并萌发叶片，但生长异长，而以假鳞茎细胞悬浮液为材料则不能获得植株，只有以种子为外植体能培养出健康的组培苗。从前人研究可见，以种子和原球茎为外植体能培养出新的植株，而以叶片为材料则不能得到新的组培苗，鳞茎为外植体很难获得植株，本发明提供了一种基于体细胞胚途径的组织快繁技术。

发明内容

针对现有技术中存在的上述问题，本发明的目的在于设计提供了一种基于体细胞胚途径的组织快繁技术方案，解决无法从叶片、假鳞茎和根尖等植株组织诱导生成愈伤组织，并进一步组培扩繁独蒜兰健康种苗的难题，实现快速、批量扩繁独蒜兰种苗。

所述的一种独蒜兰组培扩快方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）外植体的选择与灭菌

外植体的选择：选择健康的3~4年的植株，在独蒜兰开花期间进行人工辅助授粉，提高坐果率，经过1~3个月精心培育，在果荚成熟转黄前采摘，要求果荚外皮青绿色，无病斑无伤疤，果荚内壁组织幼嫩、外皮组织未完全纤维化；