[发明专利]一种基于体细胞胚途径的独蒜兰组织快繁方法

权利要求书

1. 一种基于体细胞胚途径的独蒜兰组织快繁方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）外植体的选择与灭菌

外植体的选择：选择健康的3~4年的植株，在独蒜兰开花期间进行人工辅助授粉，提高坐果率，经过1~3个月精心培育，在果荚成熟转黄前采摘，要求果荚外皮青绿色，无病斑无伤疤，果荚内壁组织幼嫩、外皮组织未完全纤维化；

外植体的灭菌：果荚用洗洁精水浸泡10~15min，用毛刷刷净种壳表面，并用自来水冲洗15~30min；在超净工作台上用75%酒精表面灭菌处理20~40 s，0.1%升汞浸泡灭菌5~15min，用无菌水冲洗5~6次，无菌滤纸吸干果荚表面水分；

（2）诱导培养

诱导培养基选用B5，添加0.1~1.0mg/L NAA，在超净工作台上用手术刀和镊子将灭菌好的果荚两端切除，纵向剖开果荚，将果荚内的未成熟的种子剔除，把果荚内壁组织剥离接种到诱导培养基上，温度为24℃~26℃，放到培养室暗培养30~60天后，待长出愈伤组织后转入光照培养；光照培养的光照强度为1800~2500lx，光照时间为10~14小时/天，直至产生绿色丛生芽；

（3）增殖培养

将绿色芽丛切割分离进行增殖培养，平均30~60天增殖一代，每代增殖5~10倍；增殖培养基采用MS，添加0.2~0.8 mg/L 6-BA和 0.1~0.6 mg/L KT，设置温度为24℃~26℃，光照强度为1800~2500lx,光照时间为10~14小时/天；

（4）生根培养

经过90~150天培养，绿色丛生芽在形态上进一步分化形成原球茎丛，将原球茎丛在无菌操作台上分割，选取直径超过0.5cm的原球茎，接种至生根培养基；生根培养基选用1/2MS+ 0.2~0.8mg/L 6-BA +0.1~0.6mg/L KT；培养温度为24℃~26℃，光照强度为1800~2500lx，光照时间为10~14小时/天，生根时间为30~40天；

（5）驯化培养：将生根良好的健壮瓶苗取出组培室，打开瓶盖放置3~5天，将苗倒出洗净培养基，用稀释到800~1000倍的多菌灵浸泡独蒜兰瓶苗根部5~10min，洗净阴干水分，将其移栽到基质中进行驯化栽培。

2. 如权利要求1所述的一种基于体细胞胚途径的独蒜兰组织快繁方法，其特征在于（1）中：选取1~3个月龄的果荚，果荚用洗洁精水浸泡时间为12~13min，用自来水冲洗20~25min；用75%酒精表面灭菌处理25~35 s，0.1%升汞浸泡灭菌8~12min。

3.如权利要求1所述的一种基于体细胞胚途径的独蒜兰组织快繁方法，其特征在于步骤（2）诱导培养中：NAA的浓度为0.2~0.5mg/L，光照强度为2000~2200lx，光照时间为12~13小时/天。

4.如权利要求1所述的一种基于体细胞胚途径的独蒜兰组织快繁方法，其特征在于步骤（2）诱导培养中：NAA的浓度为0.4~0.5mg/L。

5. 如权利要求1所述的一种基于体细胞胚途径的独蒜兰组织快繁方法，其特征在于步骤（3）增殖培养中：增殖培养基采用MS，添加0.3~0.6 mg/L 6-BA和 0.2~0.3 mg/L KT；设置温度为25℃，光照强度为2000~2200lx，光照时间为11~12小时/天。

6. 如权利要求1所述的一种基于体细胞胚途径的独蒜兰组织快繁方法，其特征在于步骤（4）生根培养中：生根培养选用1/2MS+ 0.3~0.5mg/L 6-BA +0.2~0.4mg/L KT；培养温度为25℃，光照强度为2000~2200lx，光照时间为12~13小时/天。

7.如权利要求1所述的一种基于体细胞胚途径的独蒜兰组织快繁方法，其特征在于步骤（4）生根培养中：当原球茎丛的原球茎直径超过0.5cm时，在无菌操作台上分割成1~2个原球茎为1丛，并接种至生根培养基进行生根，生根时间30~40天。

8.如权利要求1所述的一种基于体细胞胚途径的独蒜兰组织快繁方法，其特征在于：内壁组织诱导培养前期温度为24℃~26℃，放到培养室暗培养30~60天后，待长出愈伤组织后转入光照培养；以后光照诱导培养、增殖培养和生根培养的温度为24℃~26℃，光照强度为2000~2500lx，光照时间为10~14小时/天。