[发明专利]一种具备B谱系分化潜能的人造血祖细胞的制备方法及其应用

说明书

本发明提供了一种具备B谱系分化潜能的人造血祖细胞的制备方法及其应用，所述制备方法包括：将RUNX1、HOXA9和LHX2三个转录因子同时或者分别导入人多能干细胞诱导分化体系的细胞，并进行诱导表达与诱导分化，得到所述具备B谱系分化潜能的人造血祖细胞；所述人多能干细胞诱导分化体系的细胞包括人多能干细胞、中胚层细胞、生血内皮细胞或造血祖细胞中的任意一种或至少两种的组合；所述诱导分化的方法包括基于基质细胞共培养的单层培养诱导分化方法或类器官三维培养诱导分化方法。所述制备方法具有良好的诱导及分化效率，制备得到的细胞的活性好、分化能力高，具有重要的应用价值。

技术领域

本发明属于免疫学技术领域，尤其涉及一种具备B谱系分化潜能的人造血祖细胞的制备方法及其应用。

背景技术

B细胞是人体体液免疫系统的关键细胞成分，B细胞功能低下或缺陷的患者，比如老年人或者有基础疾病的患者，将会导致体液免疫受损，甚至出现严重的病原体感染。此外，基因工程改造的B细胞（engineering B cells）在临床上的抗感染、抗肿瘤以及疾病治疗领域有非常可观的应用前景。

然而，临床上B细胞以及B细胞衍生的丙种球蛋白制剂等药物来源于人体的外周血或者骨髓库，资源有限，制备耗时较长，成本较高。多能干细胞（pluripotent stem cells，PSCs）是一类具有无限增殖潜能、多谱系分化潜力、方便进行基因编辑修饰的细胞，是细胞疗法再生医学研究的热点。因此，实现多能干细胞诱导人B细胞种子再生将有望造福众多体液免疫系统异常的患者，极大地推动基因工程改造的B细胞疗法的应用。但是，目前关于多能干细胞诱导人B细胞再生的研究报道非常少，迄今为止没有实质性进展与突破，更没有临床转化的案例。这说明B细胞再生领域还有很高的壁垒需要克服。

研究表明，人多能干细胞在体外与基质细胞共培养可以依次诱导出造血祖细胞、B祖细胞以及CD19⁺sIgM⁺B细胞（French, Anna et al. Human induced pluripotent stemcell-derived B lymphocytes express sIgM and can be generated via a hemogenicendothelium intermediate. Stem cells and development vol. 24,9 (2015): 1082-95.）。但是体外无法诱导产生成熟的B细胞，且体外诱导的方式耗时较长、效率较低。直接从体外诱导出有功能、成熟的人B细胞的技术方法存在很大的困难，因此研究人员开始考虑通过体内移植的方式实现人B细胞再生。

目前仅有少量关于体内B细胞再生的研究，主要是通过体外诱导多能干细胞诱产生B祖细胞，再将其移植入动物模型中实现B细胞再生。但是存在以下的问题：第一，B细胞在体内存在的时间很短暂，同时在移植后6~8周后就检测不到分泌的抗体（Potocnik, A J etal. Reconstitution of B cell subsets in Rag deficient mice by transplantationof in vitro differentiated embryonic stem cells. Immunology letters vol. 57,1-3 (1997): 131-7）；第二，不能获得对适应性体液免疫应答更重要的B2细胞（Lin, Yanget al. Long-Term Engraftment of ESC-Derived B-1 Progenitor Cells SupportsHSC-Independent Lymphopoiesis. Stem cell reports vol. 12,3 (2019):572-583）。以上研究表明，多能干细胞体外诱导B祖细胞以及B祖细胞移植后进行体内B细胞再生的系统存在一定的缺陷，推测可能缺乏了特定的转录因子导致再生的B淋巴细胞谱系存在一定的缺陷。