[发明专利]新型CRISPR-Cas9抑制蛋白及其改造应用于化学可控的基因编辑的方法

说明书

本发明公开了新型CRISPR‑Cas9抑制蛋白及其改造应用于化学可控的基因编辑的方法。发明人从Streptococcus的移动元件中发现了九种新型的II‑A型Acr(AcrIIA24‑32)蛋白家族，这些Acr蛋白可以在细菌和真核细胞中有效抑制II‑A型Cas9直系同源蛋白。另外AcrIIA25.1和AcrIIA32.1可以同时抑制SpyCas9的DNA结合和DNA切割活性，显示出新颖而独特的抑制机制。基于此，发明人开发了新型的化学诱导型iAcr系统，建立了有效的化学可控的基因编辑的方法。本发明具有重要的应用价值。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及新型CRISPR-Cas9抑制蛋白及其改造应用于化学可控的基因编辑的方法。

背景技术

成簇的规律间隔的短回文重复序列(Clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats，CRISPR)及其CRISPR相关蛋白(CRISPR-associated，Cas)构成了原核生物适应性免疫防御系统，以防御包括噬菌体和质粒在内的侵入性遗传元件。CRISPR-Cas介导的防御过程可分为三个阶段：(1)适应阶段：当噬菌体入侵时，噬菌体的一部分序列信息作为新的间隔子插入到细菌的CRISPR基因座，形成免疫记忆；(2)表达阶段：系统表达Cas基因以及加工形成成熟的CRISPRRNA(crRNA)；(3)干扰阶段：Cas蛋白在crRNA的引导下识别并破坏靶向核酸，形成免疫防御。目前基于系统发生树以及作用机制，CRISPR-Cas系统分为2大类(Class 1和Class 2)，6种类型。Class 1系统(包括I、III和IV型)使用多亚基Cas蛋白复合物靶向外源核酸；而Class 2系统(包括II、V和VI型)则依靠单一效应蛋白(如Cas9)来实现干扰，因而应用广泛。截止目前，Class 2CRISPR-Cas系统的多种亚型被鉴定并开发为多种强有力的基因编辑工具，主要包括CRISPR-Cas9、Cas12a(Cpf1)、Cas13a(C2c2)等。它们在科学研究、农业、畜牧业以及临床检测治疗等领域发挥着日益重要的作用。其中来自化脓链球菌(Streptococcuspyogenes)的Cas9(SpyCas9)是应用最为广泛的Cas效应物，并且已被发展成为一系列强有力的基因编辑工具。

然而，尽管近些年CRISPR基因编辑技术得到了长足发展，它仍面临着尚未解决的脱靶问题，使CRISPR基因编辑技术的应用受到了阻碍。为了解决这一问题，有些研究通过改造Cas蛋白或者向导RNA以提升靶向识别的特异性，或者通过可控的Cas蛋白或者导向RNA丰度与时间的表达来进一步降低脱靶效应。近年来，在原噬菌体或噬菌体中发现了一系列被称为anti-CRISPR(Acr)的蛋白，它们可以抑制多种CRISPR-Cas系统的活性，并且一些Acr蛋白(如AcrIIA4)被证明在细胞中可以通过抑制Cas9活性来降低脱靶效应。这些特性使得Acr可作为潜在的“开关”工具用于调控基于CRISPR的应用，因此Acr的探索及其分子机制研究对于基因编辑领域有着十分重要的意义。