[发明专利]基于微流控芯片-PCR技术检测布鲁氏菌的方法及系统

权利要求书

1.一种检测布鲁氏菌的方法，其特征在于，该方法包括对待测样本进行目的DNA的提取、PCR扩增以及反向斑点杂交，其中：

目的DNA的提取：采用NaI磁珠法对待测样本进行目的DNA的提取；

PCR扩增：以提取获得的DNA为模板，采用针对布鲁氏菌BCSP-31基因设计的引物，进行PCR扩增；

反向斑点杂交：PCR扩增产物在杂交膜上进行反向斑点杂交；其中，杂交膜上固定有针对布鲁氏菌BCSP-31基因设计的检测探针。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待测样本为来自个体的离体样本或环境样本；所述来自个体的离体样本为血液样本。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，NaI磁珠法中，采用的提取试剂包括1.5-6mol/L的NaI裂解液，蛋白酶K，磁珠，以及异丙醇；

优选地，针对每50μl待测样本，采用的提取试剂包括50μl ddH₂O、100μl NaI裂解液、5μlPK、5-20μl磁珠以及20-100μl异丙醇。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述目的DNA的提取利用微流控芯片技术全自动进行，或是手工提取；

其中，手工提取过程优选包括：

在离心管中加入待测样本，并加入裂解液NaI，混匀，并加入蛋白酶K，进行孵育；

在上述离心管中加入磁珠和异丙醇，混匀；

将离心管放于磁力架上静置，待Magbeads完全吸附于离心管侧壁后彻底弃去溶液，并根据需要进行漂洗；

离心管开盖室温晾干，加入洗脱液，孵育；

将离心管放于磁力架上静置，待Magbeads完全吸附于离心管侧壁后用移液器将洗脱液转移至新的离心管中-20℃保存备用。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，PCR扩增过程中，针对布鲁氏菌BCSP-31基因设计的引物具有如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示序列。

6.根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于，PCR扩增过程中，采用15μPCR反应体系，包括：DNA聚合酶(2×Taq Master Mix)7.5ul，正、反向引物各1.5μl(0.5μmol/μl)，ddH2O1.5μl，核酸模板3μl；反应循环参数：95℃预变性3min，95℃10s、50℃30s、72℃30s，45个热循环，72℃终延伸1min；

优选地，所述PCR扩增过程利用微流控芯片技术全自动进行。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，反向斑点杂交过程中，针对布鲁氏菌BCSP-31基因设计的检测探针具有如SEQ ID No.3所示序列；

优选地，所述反向斑点杂交过程利用微流控芯片技术全自动进行。

8.根据权利要求1或7所述的方法，其特征在于，反向斑点杂交过程中，杂交膜上还固定有质控探针；

优选地，杂交膜划分为多个点位，各探针采用微量点样技术被固定在杂交膜的不同点位上，其中检测探针至少1个点，空白对照探针、内参质控探针GB各至少1个点，显色质控探针重复至少3个点。

9.一种用于实现权利要求1-8任一项所述检测布鲁氏菌的方法的检测系统，其特征在于，该检测系统包括：

用于实现所述目的DNA的提取的提取试剂材料；

用于实现所述PCR扩增的扩增试剂材料；

用于实现反向斑点杂交的试剂材料。

10.根据权利要求9所述的检测系统，其特征在于，该检测系统还包括分析单元，所述分析单元按照以下方法对反向斑点杂交结果进行分析判断：

如果杂交膜的显色质控探针点有阳性斑点，内参质控点有阳性斑点，且有检测探针阳性斑点出现，提示样本为布鲁氏菌阳性；或者

如果杂交膜的显色质控探针点有阳性斑点，内参质控点有阳性斑点，且无检测探针阳性斑点出现，提示样本为布鲁氏菌阴性。

11.一种用于实现权利要求1-8任一项所述检测布鲁氏菌的方法的引物和检测探针组合物，其特征在于，所述引物具有如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示序列；所述检测探针具有如SEQ ID No.3所示序列。