[发明专利]一种生产衣康酸的黑曲霉菌株、方法及应用

说明书

本发明公开了一种生产衣康酸的黑曲霉(Aspergillusniger)菌株，所述菌株是在出发黑曲霉中同时或单独强化表达顺乌头酸脱羧酶基因cadA、线粒体三羧酸转运蛋白编码基因mttA和一个主要促进者超家族转运蛋白编码基因mfsA获得的。本发明以黑曲霉为底盘细胞，通过增强衣康酸前体供给，强化合成途径，阻断副产物合成途径等多个维度提高黑曲霉合成衣康酸水平。

技术领域

本发明属于微生物育种技术领域，尤其是一种生产衣康酸的黑曲霉菌株(Aspergillus niger)、方法及应用。

背景技术

衣康酸分子中有一个不饱和双键和两个活泼的羧基，其在轻工业、医疗产业、农业、食品等领域均具有十分广泛的应用。衣康酸已被美国能源部评为生物质附加值最高的12种产品之一，是目前具有发展前景较好的有机酸之一。在医疗方面，衣康酸及其衍生物可作为药物主要成分，与甲苯胺发生酯化反应，对中老年人常见的疾病进行预防和治疗；在美容行业，衣康酸参与高级化妆品的制备，主要是因为其可以与月桂酸-氨乙基乙醇胺的缩合物进行反应形成味唑啉衍生物。在农业方面，衣康酸作为农药中间体也可制成除草剂；在轻工业方面，主要是衣康酸可以制成润滑剂并作为羧基化剂形成丁苯乳胶，用于纸张涂布。因此，在国内外市场上对衣康酸的需求量与日俱增。

目前，衣康酸的合成方法有两种，分别是化学合成法和微生物发酵法。化学合成法包括柠檬酸合成法和石油化工产品合成法。柠檬酸合成法是以柠檬酸为原料在高温减压条件下，经磷酸盐催化形成衣康酸和柠康酸，然后进行异构化合成衣康酸(Mattey.etal.Critical Reviews in Biotechnology.1992,12(1-2):87-132；Willke T.etal.Applied MicrobiologyBiotechnology.2001,56(3-4):289-295)。乌头酸、异柠檬酸和其酸酐经过热解可以替代柠檬酸形成衣康酸(A Kuenz A.et al.Applied MicrobiologyBiotechnology.2018,102(9):3901-3914)。石油化工产品合成法是以石油化工产品为原料，包括丁二酸酐、丁二酸二甲酯、顺丁烯二酸酐等原料分别在硫酸钍、Al₂O₅-SiO₂、烯土/分子筛等催化剂作用下，经过高温反应形成衣康酸。化学合成法要求较高的温度、多相的催化剂和复杂的纯化分离过程加大了衣康酸合成难度，是无法与微生物发酵法抗衡的(KlementT.et al.Bioresource Technology.2013,135:422-431)。目前，微生物发酵法是工业生产上最常用的合成方法，其发酵工艺简单，生产成本低。利用土曲霉(Aspergillus terreus)菌株发酵合成衣康酸，是研究历史最长且工业生产最广泛的菌株，虽然衣康酸产量能够达到160g/L，但是由于该菌株对培养基中的杂质比较敏感，以及对氧气供应要求比较严格，这就加大了工业生产的成本(Krull S.et al.Applied MicrobiologyBiotechnology.2017,101(10):1-10；Karaffa L.et al.Applied Microbiology and Biotechnology.2019,103(7):2889-2902.)。目前，玉米黑粉菌(Ustilago maydis)菌株发酵480h衣康酸的滴度为220g/L，不仅发酵强度低，而且发酵液中还存在相当水平苹果酸和碳酸钙等其它物质，大大增加了下游分离纯化的难度和成本(Tehrani H H.et al.Biotechnology forBiofuels.2019,12(1).)。此外，玉米黑粉菌菌株对pH要求比较严格：当pH大于5时，有利于衣康酸合成；当pH低于5时，有机酸将被转化成其它物质，例如糖脂和多元醇等，这就使得发酵过程控制难度加大(GeiserE.et al.Fungal BiologyBiotechnology.2014,1(1):1-10.)。

黑曲霉作为一种GRAS菌株，生产所需营养成分要求简单，具有较强耐酸性，在pH低于2的条件下仍可正常生长。黑曲霉可以利用多种廉价的碳源，具有很高的碳源转化效率，这些特点使其发展成为出色的有机酸发酵细胞工厂。