[发明专利]一种生产衣康酸的黑曲霉菌株、方法及应用

权利要求书

1.一种生产衣康酸的黑曲霉(Aspergillus niger)菌株，其特征在于：所述菌株是在出发黑曲霉中同时或单独强化表达顺乌头酸脱羧酶基因cadA、线粒体三羧酸转运蛋白编码基因mttA和一个超家族转运蛋白编码基因mfsA获得的。

2.根据权利要求1所述的生产衣康酸的黑曲霉菌株，其特征在于：所述顺乌头酸脱羧酶基因cadA的DNA序列为SEQ ID NO.1以及相似性70％以上的DNA序列，其氨基酸序列为SEQID NO.2以及相似性80％以上的氨基酸序列；

或者，所述线粒体三羧酸转运蛋白编码基因mttA的DNA序列为SEQ ID NO.3以及相似性70％以上的DNA序列，其氨基酸序列为SEQ ID NO.4以及相似性80％以上的氨基酸序列。

或者，所述超家族转运蛋白编码基因mfsA的DNA序列为SEQ ID NO.5以及相似性70％以上的DNA序列，其氨基酸序列为SEQ ID NO.6以及相似性80％以上的氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的生产衣康酸的黑曲霉菌株，其特征在于：单独或者组合强化表达玉米黑粉菌胞质乌头酸-D-异构酶基因adi1、反式-乌头酸脱羧酶基因tad1和衣康酸转运蛋白编码基因itp1。

4.根据权利要求3所述的生产衣康酸的黑曲霉菌株，其特征在于：所述玉米黑粉菌胞质乌头酸-D-异构酶基因adi1的DNA序列为SEQ ID NO.7以及相似性70％以上的DNA序列，其氨基酸序列为SEQ ID NO.8以及相似性80％以上的氨基酸序列；

或者，所述反式-乌头酸脱羧酶基因tad1的DNA序列为SEQ ID NO.9以及相似性70％以上的DNA序列，其氨基酸序列为SEQ ID NO.10以及相似性80％以上的氨基酸序列；

或者，所述衣康酸转运蛋白编码基因itp1的DNA序列为SEQ ID NO.11以及相似性70％以上的DNA序列，其氨基酸序列为SEQ ID NO.12以及相似性80％以上的氨基酸序列。

5.根据权利要求3或4所述的生产衣康酸的黑曲霉菌株，其特征在于：敲除衣康酰辅酶A转移酶基因ictA。

6.根据权利要求5所述的生产衣康酸的黑曲霉菌株，其特征在于：所述敲除衣康酰辅酶A转移酶基因ictA的DNA序列为SEQ ID NO.13以及相似性70％以上的DNA序列，其氨基酸序列为SEQ ID NO.14以及相似性80％以上的氨基酸序列。

7.根据权利要求1至6任一项所述的生产衣康酸的黑曲霉菌株，其特征在于：所述出发黑曲霉菌株的编号为S575；

或者，所述控制基因强化表达的启动子为黑曲霉3-磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子PgpdA，丙酮酸激酶基因启动子PpkiA，黑曲霉乙醇脱氢酶基因启动子PadhA，泡盛曲霉和黑曲霉谷氨酸脱氢酶基因启动子PgdhA，构巢曲霉ATP合成酶基因启动子PoliC，米曲霉磷酸甘油酸激酶基因启动子PpgkA，构巢曲霉磷酸丙糖异构酶基因启动子PtpiA，黑曲霉多蛋白桥接因子1启动子PmbfA,黑曲霉苹果酸脱氢酶基因PmdhA，黑曲霉细胞色素c氧化酶亚基4启动子PcoxA，黑曲霉蛋白质sip5启动子PsrpB。

8.如权利要求1至7任一项所述的生产衣康酸的黑曲霉菌株在生产衣康酸中的应用。

9.利用如权利要求1至7任一项所述的生产衣康酸的黑曲霉菌株发酵高产衣康酸的方法，其特征在于：步骤如下：

首先，将黑曲霉菌株接种在PDA培养平板上，在0～28℃培养0～10天，直至产生分生孢子；然后，将孢子接种至衣康酸发酵培养基中，孢子的终浓度为1×10⁴～2×10⁶个孢子/mL，在0～40℃、0～300rpm条件下发酵0～15天，可得衣康酸。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述衣康酸发酵培养基的具体成分为：0～200g/L葡萄糖，0～5g/L柠檬酸钠×2H₂O，0～10g/LKH₂PO₄，0～5g/LNH₄NO₃，0～2g/LMgSO₄×7H₂O，0～2g/L CaCl₂×H₂O，0～2g/L柠檬酸×H₂O，0～2g/LZnSO₄×7H₂O，0～1g/LFe(NH₄)₂(SO₄)₂×7H₂O，0～1mg/L CuSO₄×5H₂O，0～1mg/L MnSO₄×H₂O，0～2mg/L H₃BO₃，0～2g/LNa₂MoO₄×2H₂O，0～2mg/L生物素和0～400g/L吗啉乙磺酸，初始pH＝2～8；

或者，所述发酵的条件为：35℃，250rpm条件下，发酵第6天，衣康酸滴度达到20g/L，糖酸转化率为0.34mol/mol。