[发明专利]ELISA试剂盒及其制备方法和检测方法

说明书

本发明提供一种ELISA试剂盒及其制备方法和检测方法。该ELISA试剂盒以点击化学进行信号放大，是铜催化的叠氮炔烃环加成反应(CuAAC)，通过合成炔烃化链霉亲和素或叠氮化链霉亲和素作为检测生物素的探针，再加入点击化学反应底物叠氮化生物素或炔烃化生物素，增加检测抗体上生物素的数量，然后再和链霉亲和素标记的HRP结合，从而起到放大信号的效果，有效地提高了检测人IL‑6的实际样本的灵敏度。

技术领域

本发明涉及免疫检测技术领域，具体涉及一种ELISA试剂盒及其制备方法和检测方法。

背景技术

酶联免疫吸附试验(ELISA)是上世纪70年代发展起来的基于抗原抗体特异性反应的检测方法，被广泛用于各种样本中抗原抗体的检测。ELISA检测方法的基本原理是将具有催化活性的酶共价偶联在检测抗体或抗原上，偶联物同时具有抗原抗体结合活性和酶活性，与固相载体上的抗原或抗体进行特异性结合，加入酶促底物后发生显色反应，根据显色反应强弱来衡量检测样本当中抗原抗体的含量。目前ELISA试剂盒中的催化酶主要采用辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(ALP)，显色底物主要为四甲基联苯胺(TMB)，在HRP和H₂O₂存在条件下，TMB氧化产生蓝色的联苯醌，在强酸作用下转换成黄色的，最大吸收波长为450nm。

ELISA检测方法应用比较广泛，但是行业内对该方法的检测灵敏度要求越来越高。

发明内容

基于此，有必要提供一种能够提升样本检测灵敏度的ELISA试剂盒及其制备方法和检测方法。

本发明采用如下技术方案：

本发明提供一种ELISA试剂盒，包括能够进行点击反应的探针和底物，所述点击反应为采用铜离子催化探针、底物上叠氮基团与炔烃基团的点击反应。所述探针为叠氮化链霉亲和素或者炔烃化链霉亲和素，相应地，所述底物为炔烃化生物素或者叠氮化生物素。所述叠氮化链霉亲和素由链霉亲和素和叠氮化试剂反应制备而成，所述炔烃化链霉亲和素由链霉亲和素和炔烃化试剂反应制备而成。

在其中一些实施例中，所述炔烃化生物素选自Biotin-PEG4-Alkyne或者PEG4carboxamide-Propargyl Biotin(Thermo)。

在其中一些实施例中，所述叠氮化生物素选自Biotin Picolyl Azide、Biotin-PEG3-Azide、PEG4 carboxamide-6-Azidohexanyl Biotin(Thermo)中的至少一种。

在其中一些实施例中，铜离子催化剂选自BTTES、TBTA、BTTP、BTTAA、THPTA中的中，优选为BTTAA、THPTA。

在其中一些实施例中，所述的ELISA试剂盒还包括HRP标记的链霉亲和素、铜离子催化剂、TMB显色液和/或终止液。

在其中一些实施例中，所述的ELISA试剂盒还进一步包括包被物质和/封闭液。

本发明提供一种ELISA检测方法，采用上述项所述的ELISA试剂盒，采用叠氮化/炔烃化链霉亲和素作为探针和生物素结合，再加入炔烃化/叠氮化生物素进行反应，再加入HRP记的链霉亲和素进行反应，测试OD值。该信号放大的ELISA检测方法在人IL-6双抗夹心ELISA检测样本中的应用。

本发明还提供一种检测人IL-6的酶联免疫吸附试验方法，包括以下步骤：(1)合成叠氮化/炔烃化链霉亲和素；(2)在酶标板上包被及封闭人IL-6的包被抗体；(3)加入标准品/样本及生物素化检测抗体；(4)加入叠氮化/炔烃化链霉亲和素，使其与生物素结合；(5)再加入点击化学试剂，使叠氮化/炔烃化基团转变成生物素；(6)然后加入链霉亲和素标记的HRP酶，显色检测OD值。