[发明专利]一种具有功能性的双超分子相互作用水凝胶、制备方法及应用

说明书

本发明公开了一种具有功能性的双超分子相互作用水凝胶、制备方法及应用。水凝胶是由荧光蛋白‑高分子聚合物结合体、纳米抗体多聚体和α‑环糊精反应得到，荧光蛋白‑高分子聚合物结合体由修饰有反应位点的绿色荧光蛋白GFP和马来酰亚胺‑聚乙二醇反应得到，修饰有反应位点的绿色荧光蛋白GFP的序列如SEQ ID NO：1所示，纳米抗体多聚体的序列如SEQ ID NO：2所示。本发明的水凝胶通过双超分子相互作用实现很高的弹性模量和粘性模量，并且无毒副作用，可用于生物材料；其可形貌转变，可以有效地招募和活化巨噬细胞，表现出肿瘤免疫治疗的前景；可用于细胞成像，具有优异的推广应用价值和潜力。

技术领域

本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种具有功能性的双超分子相互作用水凝胶、制备方法及应用。

背景技术

聚合物水凝胶是由三维网络结构的聚合物和大量的水组成。特别是近几年来，人们对它的研究兴趣日益浓厚，因为水凝胶中含有大量的水和少量的有机物，是一种绿色的软材料。然而，采用化学交联剂交联的水凝胶存在一些缺陷，例如：力学强度差和易脆等。目前研究最多的准聚轮烷(PPR)水凝胶是由PEG和α-环糊精(α-CD)组成，串在PEG上的α-CD之间可以形成结晶微区，成为物理交联点，但是其强度较低限制了其生物应用。为了解决这个问题，目前利用蛋白质多聚体作为聚合物水凝胶的交联点，可以极大地改善水凝胶的强度，但是这种水凝胶功能应用范围小，限制了其生物应用。

纳米抗体(Nanobody，NB)是一类新型抗体，它以结构稳定、分子量小、易于表达纯化、免疫原性低为典型特征，近年来迅速发展为颇具潜力的治疗性蛋白质。但是纳米抗体结构自身并不存在天然的结构域进行二聚或多聚，为了将纳米抗体多聚化，一个简便的办法是将其与能够多聚化的蛋白质序列表达成融合蛋白质，从而赋予纳米抗体多聚化的能力。卷曲螺旋(Coiled-coils，CC)是一种在天然蛋白质中广泛存在的超二级结构或结构域，特指2-5条α-螺旋卷曲在一起，成类似绳索的结构，并具有Cn或Dn对称性。近年来，卷曲螺旋已经发展称为一种较为成熟的对蛋白质进行理性设计的手段，通过卷曲螺旋可以很方便地把相同或不同的蛋白质结构域整合在一起，从而赋予其新的功能。在上述研究基础的启发下，将纳米抗体多聚化作为构筑基元引入自组装体系，并且取代化学交联剂交联实现功能性水凝胶的制备具有广阔的发展空间。遗憾的是，这方面研究目前文献中还没有关注。因此，研发基于纳米抗体多聚体为主体的功能性水凝胶用于生物医药领域具有重要意义与价值。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种具有良好的生物相容性的双超分子相互作用水凝胶、制备方法及其应用。本发明通过构筑卷曲螺旋(Coiled-coils，CC)与荧光蛋白纳米抗体(NB_GFP)的融合蛋白质，得到纳米抗体多聚体(NB_GFP-CC)，利用纳米抗体与其荧光蛋白GFP之间的特异性作用为水凝胶提供稳定的交联部分，同时，通过串在GFP-PEG链上的α-环糊精(α-CD)之间形成结晶微区，成为物理交联点。本发明水凝胶基于纳米抗体多聚体与其蛋白质为主体同时具有形貌转变、荧光成像、招募与活化巨噬细胞的特点，能为基于纳米抗体多聚体水凝胶制备和生物应用提供新的思路。

本发明的技术方案具体介绍如下。

本发明公开了一种具有功能性的双超分子相互作用水凝胶，其由荧光蛋白-高分子聚合物结合体、纳米抗体多聚体在pH 7.2的PBS缓冲液中，4℃的温度下先反应10-30h，再加入α-环糊精反应10-30h制备得到；其中：

所述荧光蛋白-高分子聚合物结合体通过融合表达巯基的荧光蛋白、高分子聚合物和还原剂三(2-羧乙基)膦TCEP在pH 7.2的PBS缓冲液中亲核加成反应得到；融合表达巯基的荧光蛋白的尾部有暴露出巯基SH的半胱氨酸残基，其由绿色荧光蛋白GFP在蛋白质序列的C端添加一段甘氨酸柔性链，并最后添加半胱氨酸Cys获得；高分子聚合物为马来酰亚胺-聚乙二醇PEG-MAL，其化学结构式如下：