[发明专利]一种突变后的K亚群禽白血病病毒受体基因及其在抗K亚群禽白血病病毒感染中的应用

说明书

本发明公开了一种突变后的K亚群禽白血病病毒(ALV‑K)受体基因(Tva)及其在抗K亚群禽白血病病毒感染中的应用。本发明鉴定了介导ALV‑K感染鸡细胞的受体蛋白Tva的关键功能性氨基酸位点E53、L55、H59及G70，发现将这四个位点突变后，将导致ALV‑K无法感染宿主细胞。进一步的，本发明还公开了一种构建抗ALV‑K感染的DF‑1细胞系的方法，该方法利用CRISPR/Cas9方法和流式细胞术筛选，将Tva基因作为ALV‑K受体的关键氨基酸位点E53、L55、H59及G70进行突变。结果表明，含有上述位点突变的替换序列可高效定点替换Tva基因的相应序列；Tva基因编辑细胞系可在不影响细胞增殖水平的条件下抵抗ALV‑K的感染。本发明的提出为进一步研究Tva基因的功能及建立抗ALV‑K感染新技术奠定了基础。

技术领域

本发明涉及一种突变后的K亚群禽白血病病毒受体基因(Tva)及其在抗K 亚群禽白血病病毒(ALV-K)感染中的应用。本发明属于生物技术领域。

背景技术

禽白血病(AL)是由禽白血病病毒(Avian leukosis virus，ALV)引起的一种造成禽类肿瘤的种源性疾病。ALV属于α-反转录病毒属，为有囊膜的RNA病毒。根据其囊膜蛋白的不同，目前，ALV被划分为A-J 10个亚群，近年来在我国又出现了新的ALV亚群，指定为K亚群(Cui N,Su S,Chen Z,et al.Genomic sequence analysis and biologicalcharacteristics of a rescued clone of avian leukosis virus strain JS11C1,isolated from indigenous chickens[J].J Gen Virol,2014,95(Pt 11):2512- 2522.)。ALV-K作为新出现的ALV亚型，其主要引起感染鸡群的胶质瘤。

不同亚群ALV利用不同的表面蛋白作为受体感染宿主细胞。但是，所有亚型的ALV的囊膜蛋白与受体分子的特异性氨基酸相互作用都是其建立感染至关重要的一步。A亚群禽白血病病毒(ALV-A)受体基因(Tva)同时也为ALV-K的细胞受体基因，其含有一个称为LDL-A的结构域，为介导病毒进入的关键功能域，Tva介导ALV-K感染的关键氨基酸E53、L55、H59及G70位于该LDL-A结构域中。Tva作为人CD320的同源基因，是一个TC介导的Cbl(维生素B12) 摄取的细胞受体分子之一，因此，Tva对于鸡的生长至关重要。

删除或突变受体分子介导病毒进入宿主细胞的关键功能域或关键氨基酸，使受体丧失介导病毒进入细胞的能力，同时保留其维持细胞正常生命活动的功能，是最好的以受体分子为靶分子建立抗ALV感染鸡的策略。CRISPR/Cas9基因编辑技术作为新一代基因编辑技术，可实现基因的“精准”编辑，这为抗病鸡的构建提供了有利的工具。

因此，本发明拟通过利用CRISPR/Cas9技术对Tva介导ALV-K入侵的关键氨基酸位点进行基因突变或缺失，为进一步构建抗ALV-K的基因编辑鸡奠定基础。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种突变后的K亚群禽白血病病毒(ALV-K)受体基因(Tva)及其在抗K亚群禽白血病病毒感染中的应用；

本发明的目的之二在于提供一种利用上述突变后的K亚群禽白血病病毒受体基因(Tva)构建抗K亚群禽白血病病毒感染的DF-1细胞系的方法。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

一种突变后的K亚群禽白血病病毒受体基因(Tva)，其特征在于，所述的突变后的K亚群禽白血病病毒受体基因(Tva)所编码的Tva蛋白的第53、55、59 及70位氨基酸位点发生了突变或缺失。