[发明专利]一种突变后的K亚群禽白血病病毒受体基因及其在抗K亚群禽白血病病毒感染中的应用在审
| 申请号： | 202210114185.3 | 申请日： | 2022-01-30 |
| 公开（公告）号： | CN115704033A | 公开（公告）日： | 2023-02-17 |
| 发明（设计）人： | 高玉龙;王笑梅;祁小乐;王素艳;刘长军;张艳萍;崔红玉;李凯;高立 | 申请（专利权）人： | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心) |
| 主分类号： | C12N15/12 | 分类号： | C12N15/12;C12N15/113;C12N5/10;C12N15/55;C12N15/85;C07K14/705 |
| 代理公司： | 北京科龙寰宇知识产权代理有限责任公司 11139 | 代理人： | 马鑫 |
| 地址： | 150009 黑龙*** | 国省代码： | 黑龙江;23 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 突变 亚群禽 白血病病毒 受体 基因 及其 白血病 病毒感染 中的 应用 | ||
1.一种突变后的K亚群禽白血病病毒受体基因(Tva)，其特征在于，所述的突变后的K亚群禽白血病病毒受体基因(Tva)所编码的Tva蛋白的第53、55、59及70位氨基酸位点发生了突变或缺失。
2.如权利要求1所述的突变后的K亚群禽白血病病毒受体基因(Tva)，其特征在于，所述的突变后的K亚群禽白血病病毒受体基因(Tva)的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.权利要求1或2所述的突变后的K亚群禽白血病病毒受体基因(Tva)在研究Tva基因的功能以及通过基因编辑的方法制备抗K亚群禽白血病病毒的生物材料中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的生物材料为抗K亚群禽白血病病毒感染的细胞系。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的细胞系为DF-1细胞系。
6.一种构建抗K亚群禽白血病病毒感染的DF-1细胞系的方法，其特征在于，所述的方法利用CRISPR/Cas9方法和流式细胞术筛选，将K亚群禽白血病病毒受体基因(Tva)所编码的Tva蛋白的第53、55、59及70位氨基酸位点进行了突变或缺失。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，突变后的K亚群禽白血病病毒受体基因(Tva)的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
8.如权利要求6或7所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)Tva-sgRNA敲除质粒的构建
合成Tva敲除引导RNA序列，并将该序列插入到pMD-18T载体中，构建得到Tva-sgRNA敲除质粒，其中，所述的引导RNA序列如SEQ ID NO.2所示；
(2)ssODN序列的合成
合成SEQ ID NO.3所示的ssODN序列，将原始Tva基因所编码的第E53、L55、H59及G70位氨基酸进行突变表达；
(3)r-Tva细胞系的构建及筛选
将pCas9-GFP质粒、Tva-sgRNA质粒及ssOND共转入DF-1细胞内，培养48h后，使用流式细胞分选仪筛选带有GFP荧光的细胞，将阳性细胞接入96孔板中，7d后于光学显微镜下观察筛选单克隆细胞系并扩大培养；
(4)细胞系的鉴定
使用基因组提取试剂盒提取单克隆细胞系的基因组，分别选取突变位点的上下游的一段序列作为引物进行PCR扩增，并对扩增的产物进行测序分析，替换序列成功插入Tva基因中，表明成功获得抗K亚群禽白血病病毒感染的DF-1细胞系。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(4)中所述的引物序列为：
Tva-CX-F：gttctttggcgcagtgctc；
Tva-CX-R：cgctgcagctgagctttatg。
10.按照权利要求6-9中任一项所述的方法构建得到的抗K亚群禽白血病病毒感染的DF-1细胞系。
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