[发明专利]一种抗心衰中药质量标志物发现方法及四逆汤质量标志物群

说明书

本发明公开了一种抗心衰中药质量标志物发现方法，该方法包括：一、抗心衰中药提取液的制备；二、心肌线粒体提取；三、心肌线粒体膜色谱柱的制备；四、心肌线粒体膜二维液相色谱分析系统的建立；五、心肌线粒体膜二维液相色谱分析系统的选择性考察；六、抗心衰中药质量标志物的发现；本发明还公开了一种四逆汤质量标志物群。本发明以心肌线粒体膜为靶标筛选得到抗心衰中药质量标志物，具有快速，高通量，筛选结果准确度高的优点；本发明获得四逆汤中的抗心衰中药质量标志物，实现了四逆汤基于药效成分的质量评价，破解了四逆汤制剂质量的参差不齐导致用药疗效预期不明确及四逆汤质量评价与其药效不关联的问题。

技术领域

本发明属于医药生物领域，具体涉及一种抗心衰中药质量标志物发现方法及四逆汤质量标志物群。

背景技术

心力衰竭是所有心脏疾病的最终转归，具有高再住院率、致残率及致死率的特点，给社会和家庭带来了极大的经济负担。中医药已成为心衰综合治疗的重要手段之一，很多中药产品(如中药饮片、中药煎剂、中药提取物、中成药制剂)具有抗力衰竭作用，如四逆汤，参附汤，芪附汤等。长期以来，中药质量控制手段、质量评价指标及质量标准与其有效性关联不强，严重影响中药的临床疗效和安全性。抗心衰中药的质量控制亦是如此，如四逆汤，它是由附子、干姜和甘草三味中药组成的多成分复杂体系。《中国药典》(2020版)以甘草酸和乌头碱作为四逆汤的质控成分，难以确保其临床疗效的稳定，存在非常大的安全隐患。因此中药产品质量控制的新概念：中药质量标志物(Q-Marker)被提出。中药Q-marker是存在于中药材和中药产品中固有的或加工制备过程中形成的、与中药的功能属性密切相关的化学物质。中药Q-marker是中药质量的标示性物质，必须与中药的有效性密切相关。目前中药质量标志物研究刚刚起步，抗心衰中药产品尚缺少一种普适性的质量标志物的研究方法。因此，寻找一种可被广泛接受的抗心衰中药质量标志物研究策略尤为重要。

近年来，“能量耗竭学说”已成为国际心力衰竭研究领域的热点(Ingwall JoanneS.Energy metabolism in heart failure and remodelling.Cardiovascular Research,2009,81(3):412-419.；Bertero Edoardo,Maack Christoph.Metabolic remodelling inheart failure.Nature Reviews Cardiology,2018,15(8):457-470.)。线粒体(Mitochondria)是细胞内含有双层膜结构的细胞器，是细胞能量生成的关键细胞器。研究表明心力衰竭的发病和进展过程中，线粒体既是心力衰竭时病理因子攻击的靶标，也是心力衰竭时各种病理变化的起源(Kumar Vikas,Kumar T.R.Santhosh,KarthaC.C.Mitochondrial membrane transporters and metabolic switch in heartfailure.Heart Failure Reviews,2019,24(2):255-267.；Brown David A.,Perry JustinB.,Allen Mitchell E.,Sabbah Hani N.,Stauffer Brian L.,Shaikh Saame Raza,Cleland John G.F.,Colucci Wilson S.,Butler Javed,Voors Adriaan A.,AnkerStefan D.,Pitt Bertram,Pieske Burkert,Filippatos Gerasimos,Greene Stephen J.,Gheorghiade Mihai.Mitochondrial function as atherapeutic target in heartfailure.Nature Reviews Cardiology,2017,14(4):238-250.)。线粒体膜存在众多药物靶点，如渗透转换孔复合体(mPTP)、18kDa转位分子蛋白(TSPO)、线粒体电压依赖性阴离子通道(VDAC)等，线粒体膜已成为心力衰竭治疗的重要靶标(Brown David A.,Perry JustinB.,Allen Mitchell E.,Sabbah Hani N.,Stauffer Brian L.,Shaikh Saame Raza,Cleland John G.F.,Colucci Wilson S.,Butler Javed,Voors Adriaan A.,AnkerStefan D.,Pitt Bertram,Pieske Burkert,Filippatos Gerasimos,Greene Stephen J.,Gheorghiade Mihai.Mitochondrial function as a therapeutic target in heartfailure.Nature Reviews Cardiology,2017,14(4):238-250.)。例如，Sharov等研究发现mPTP阻断剂环孢菌素A能够改善心力衰竭犬离体心肌细胞的线粒体呼吸链功能(SharovVictor G.,Todor Anastassia,Khanal Sanjaya,Imai Makoto,Sabbah HaniN.Cyclosporine A attenuates mitochondrial permeability transition andimproves mitochondrial respiratory function in cardiomyocytes isolated fromdogs with heart failure.Journal of Molecular and Cellular Cardiology,2007,42(1):150-158.)；De Tassigny等研究发现4'-氯地西泮能够与线粒体外膜上的TSPO结合，抑制线粒体ROS的产生和线粒体膜通透性转换孔的开放，减轻阿霉素诱导的心肌细胞死亡(deTassigny Alexandra d'Anglemont,Assaly Rana,Schaller Sophie,Pruss Rebecca M.,Berdeaux Alain,Morin Didier.Mitochondrial translocator protein(TSPO)ligandsprevent doxorubicin-induced mechanical dysfunction and cell death in isolatedcardiomyocytes.Mitochondrion,2013,13(6):688-697.)。因此，以心肌线粒体膜为靶标，寻找与心肌线粒体膜结合成分，可发现抗心衰中药质量标志物。生物色谱技术的发展为寻找心肌线粒体膜结合成分提供可能，然而现阶段仍然缺少基于心肌线粒体膜色谱的抗心衰中药质量标志物的发现的方法。