[发明专利]一种抗心衰中药质量标志物发现方法及四逆汤质量标志物群

权利要求书

1.一种抗心衰中药质量标志物发现方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

步骤一、抗心衰中药提取液的制备：向抗心衰中药中加入溶剂进行提取得到粗提液，将粗提液过滤得到滤液，滤液经静置后再次过滤并回收溶剂，然后补加去离子水复溶，得到抗心衰中药原液，使用时，将抗心衰中药原液稀释后进行微孔过滤，得到抗心衰中药提取液；

步骤二、心肌线粒体提取：

步骤201、向剪碎的大鼠心脏组织中加入胰蛋白酶在冰浴条件下搅拌酶解，然后加入胰蛋白酶抑制剂搅拌，洗涤后采用细胞滤网过滤，得到的滤饼为酶解组织，将酶解组织在4℃下匀浆后进行一次离心，得到一次上清液和一次沉淀，将一次上清液在4℃下进行二次离心得到二次上清液和二次沉淀，将二次沉淀在4℃下进行三次离心得到三次上清液和三次沉淀，该三次沉淀即为线粒体粗提物；

步骤202、将步骤201中得到的线粒体粗提物进行一次重悬浮，得到的重悬液在4℃下进行一次离心，采用巴斯德吸管吸取离心后重悬液中的线粒体条带，然后稀释并在4℃下进行二次离心，得到的沉淀经二次重悬浮后在4℃下进行三次离心，得到的沉淀物经三次重悬浮后，得到纯化的线粒体悬液，并置于-20℃下保存；

步骤三、心肌线粒体膜色谱柱的制备：

步骤301、固定相载体合成：将脱气硅胶与3-氨基丙基三乙氧基硅烷在甲苯溶剂、110℃、氩气保护下反应，得到的反应产物经干燥后加入戊二醛甲醇溶液，并在室温下振摇反应进行醛氨缩合，制备得到带有醛基的可与线粒体交联的固定相载体；

步骤302、心肌线粒体膜蛋白制备：将步骤202中得到的纯化的线粒体悬液进行重悬浮，然后进行破碎，得到的破碎的浆液经离心后得到线粒体膜沉淀，将线粒体膜沉淀重悬浮后得到线粒体膜悬浮液；

步骤303、心肌线粒体膜固定相制备：在真空搅拌条件下，将步骤302中得到的线粒体膜悬浮液与步骤301中得到的固定相载体进行反应并在4℃下孵育过夜，经洗涤离心后得到心肌线粒体膜固定相；

步骤304、装柱：在4℃下采用液相泵将步骤303中得到的心肌线粒体膜固定相装入色谱柱中，并进行平衡，得到心肌线粒体膜色谱柱，封柱后置于4℃备用；

步骤四、心肌线粒体膜二维液相色谱分析系统的建立：采用高效液相色谱仪及配套的二元泵、单元泵、恒温箱、在线脱气剂、自动进样器为基础，将步骤304中得到的心肌线粒体膜色谱柱作为第一维色谱柱，将C18色谱柱作为第二维色谱柱，采用电控十通阀在线串联心肌线粒体膜色谱柱和C18色谱柱，且第二维色谱柱的流出口与质谱检测器连接，构建得到心肌线粒体膜二维液相色谱分析系统；

步骤五、心肌线粒体膜二维液相色谱分析系统的选择性考察：配制含有靶向线粒体膜的阳性药和阴性药的混合溶液作为标准液，然后将标准液通入步骤四中构建的心肌线粒体膜二维液相色谱分析系统进行分析，通过考察靶向线粒体膜的阳性药和阴性药在第一维色谱柱心肌线粒体膜色谱柱上的保留性能，考察心肌线粒体膜二维液相色谱分析系统的选择性；

步骤六、抗心衰中药质量标志物的发现：将步骤一中制备的抗心衰中药提取液通入步骤五中选择性考察合格的心肌线粒体膜二维液相色谱分析系统中进行分析，获得与第一维色谱柱心肌线粒体膜色谱柱的保留结合成分，然后选择心肌线粒体膜色谱柱的保留时间界值，获得与心肌线粒体膜色谱的强结合保留成分，作为抗心衰中药质量标志物。

2.根据权利要求1所述的一种抗心衰中药质量标志物发现方法，其特征在于，步骤201中所述一次离心的条件为：740g离心力下离心5min，并重复一次，所述二次离心的条件为：9000g离心力下离心10min，所述三次离心的条件为：10000g离心力下离心10min，并重复一次。

3.根据权利要求1所述的一种抗心衰中药质量标志物发现方法，其特征在于，步骤202中所述一次离心的条件为：95000g离心力下离心30min；所述二次离心和三次离心的条件均为：6300g离心力下离心10min。

4.根据权利要求1所述的一种抗心衰中药质量标志物发现方法，其特征在于，步骤302所述破碎采用超声法，超声功率为400W，且每次超声2s停止20s，共进行7次；所述离心的条件为：12000g离心力下离心20min。