[发明专利]一种深古菌转甲基酶Ι的基因、蛋白序列及其制备方法

说明书

本发明提出了一种深古菌转甲基酶Ι的基因、蛋白序列及其制备方法，属于基因工程技术领域，所述转甲基酶Ι来源于深古菌基因组，具有转甲基活性，以带甲氧基的芳香族化合物为底物，将其中的甲基转移至咕啉环蛋白上。将深古菌转甲基酶Ι克隆到pCold‑TF表达载体，通过重组表达载体在大肠杆菌中诱导表达，经固定化镍离子亲和纯化，制备转甲基酶。该转甲基酶I可用于甲氧基的芳香族化合物的转甲基。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种深古菌转甲基酶Ι的基因、蛋白序列及其制备方法。

背景技术

利用甲氧基芳香化合物为底物的转甲基过程需要多种酶共同作用，其中包括转甲基酶Ι、类咕啉蛋白、AE激活酶、转甲基酶Ⅱ。转甲基酶Ι负责关键的底物识别及催化过程，催化甲氧基芳香化合物上的甲基转到咕啉环蛋白上，转甲基酶Ⅱ催化咕啉环蛋白上的甲基转移至四氢叶酸上，AE激活酶可将没有活性的二价钴催化成有活性的一价钴。

转甲基多酶复合体多数存在于产乙酸细菌中，近期发现这一类转甲基酶复合体在产甲烷古菌及其他古菌中也存在，但是目前报道的转甲基酶都属于细菌来源，亲源性高。

发明内容

本发明的目的在于提出一种深古菌转甲基酶Ι的基因、蛋白序列及其制备方法，所述深古菌转甲基酶I具有利用愈创木酚为底物，进行转甲基的反应活性，将甲基转移至咕啉环蛋白上，可用于甲氧基的芳香族化合物的转甲基。

本发明的技术方案是这样实现的：

本发明提供一种深古菌转甲基酶Ι的蛋白序列，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明进一步保护编码上述深古菌转甲基酶Ι蛋白序列的基因片段，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明进一步保护一种重组表达载体，包含上述的基因片段。

本发明进一步保护一种重组菌，其特征在于，包上述的重组表达载体。

作为本发明的进一步改进，所述重组菌为大肠杆菌。

本发明进一步保护一种深古菌转甲基酶Ι的制备方法，包括以下步骤：

S1.构建上述的重组表达载体；

S2.将步骤S1得到的重组表达载体转入宿主细胞，并对宿主细胞进行扩大培养、诱导表达；

S3.收集诱导培养后的宿主细胞，进行破碎、加热、离心，得到上清液；

S4.对上清液进行纯化，得到所述转甲基酶Ι。

本发明进一步保护一种上述的制备方法制得的深古菌转甲基酶Ι。

本发明进一步保护一种上述深古菌转甲基酶Ι的转甲基反应缓冲液，其特征在于，所述缓冲液反应体系中含35mmol/L Tris-HCl，70mmol/L KCl，12mmol/L MgCl₂，0.5mmol/LTi(III)citrate，2.3mmol/L ATP，0.08mg/mL激活酶，1.2mg/mL Co(II)-咕啉环蛋白，2.3mmol/L愈创木酚和0.015mg/mL Trigger Factor标签与深古菌甲基转移酶I。

本发明具有如下有益效果：本发明中的转甲基酶Ι序列与目前已报道的转甲基酶Ι序列不具有同源性。酶大小也不同，目前已报道的转甲基酶Ι大小在47kDa左右，而本发明的转甲基酶Ι大小在32kDa。另外，目前已发现的转甲基酶Ι广泛存在于不同种类的微生物，而本发明转甲基酶Ι仅存在于深古菌中。