[发明专利]基于RAA-CRISPR/Cas12a技术可视化检测玉米褪绿斑驳病毒的方法

说明书

本发明公开了基于RAA‑CRISPR/Cas12a技术可视化检测玉米褪绿斑驳病毒的方法、试剂盒及其应用。该试剂盒包括RAA引物对、ssDNA探针、crRNA和Cas12a蛋白，所述RAA引物对由MCMV‑F1引物和MCMV‑R3引物组成，所述MCMV‑F1引物为序列表中SEQ ID No.1所示的单链DNA分子，所述MCMV‑R3引物为序列表中SEQ ID No.4所示的单链DNA分子，所述ssDNA探针为序列表中SEQ ID No.13所示的单链DNA分子，所述crRNA为序列表中SEQ ID No.12所示的RNA分子。采用该试剂盒检测灵敏度高，扩增速度快，反应时间短，高效简便，不需要复杂的仪器设备，检测结果肉眼可见，适用于玉米褪绿斑驳病毒的现场快速检测。

技术领域

本发明属于生物技术领域。具体地说，本发明涉及基于RAA-CRISPR/Cas12a技术可视化检测玉米褪绿斑驳病毒的方法、试剂盒及其应用。

背景技术

玉米褪绿斑驳病毒(maize chlorotic mottle virus，MCMV)是番茄丛矮病毒科、玉米褪绿斑驳病毒属的唯一成员，属于我国进境及国内植物检疫性有害生物。2009年在我国云南首次发现，之后在四川南部地区也有发生的报道。MCMV侵染部分单子叶植物，玉米是其天然寄主。MCMV能通过昆虫(叶甲和蓟马)介体、种子和机械方式传播。MCMV单独侵染玉米引起褪绿、斑驳、矮化甚至局部坏死等症状。MCMV与甘蔗花叶病毒(sugarcane mosaicvirus，SCMV)，玉米矮花叶病毒(maize dwarf mosaic virus，MDMV)、小麦线条花叶病毒(wheat streak mosaic virus，WSMV)等马铃薯Y病毒科的一种或者几种病毒共同侵染玉米，可引起致死性坏死病，使整个植株坏死，导致严重产量损失甚至绝收。

目前针对MCMV的检测方法主要是基于病毒蛋白抗体的血清学方法及反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)。血清学方法主要是酶联免疫吸附测定(ELISA)及胶体金试纸条等，适合大量样品的检测，但灵敏度低于核酸检测方法。RT-PCR对仪器设备的依赖程度较高，需要热循环仪进行变性、退火、延伸等步骤，整个过程耗时长，成本高。

重组酶介导的核酸等温扩增(recombinase-aided ampliffication，RAA)能够在39℃左右的恒温条件下对靶标片段进行快速扩增，不需要精密温控设备。相较于PCR，RAA反应更加快速、灵敏，特异性强，目前已经用于新冠病毒、非洲猪瘟病毒、禽流感病毒等的检测，但用于植物病毒检测的报道很少。MCMV严重威胁着玉米生产安全，因此建立简单、特异、灵敏、快速的检测方法尤为重要。

近年来，基因编辑工具CRISPR/Cas系统越来越多地应用于核酸检测领域。CRISPR/Cas12a能够识别数个核苷酸的特定原型间隔子相邻模体(protospacer adjacent motif，PAM)序列(LbCas12a能够识别5′-TTTN-3′)；在crRNA的引导下，切割双链靶标DNA；切割dsDNA后，能够激活其切割单链DNA(single-stranded DNA，ssDNA)的活性。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种检测玉米褪绿斑驳病毒的方法。

本发明提供了用于检测玉米褪绿斑驳病毒的试剂盒，包括RAA引物对、ssDNA探针(例如，20nt)、crRNA和Cas12a蛋白，所述RAA引物对由MCMV-F1引物和MCMV-R3引物组成，所述MCMV-F1引物为序列表中SEQ ID No.1所示的单链DNA分子，所述MCMV-R3引物为序列表中SEQ ID No.4所示的单链DNA分子，所述ssDNA探针为序列表中SEQ ID No.13所示的单链DNA分子，所述crRNA为序列表中SEQ ID No.12所示的RNA分子。

可选地，根据上述的试剂盒，所述ssDNA探针两端分别标记荧光基团和淬灭基团BHQ1。例如，可在SEQ ID No.13的第1位碱基上标记荧光基团且第20位碱基标记淬灭基团BHQ1。