[发明专利]一种基于相分离研究磷酸化p53稳定性以及细胞内定位的方法

说明书

本发明公开了一种基于相分离研究磷酸化p53稳定性以及细胞内定位的方法。本发明构建一种体系，所述体系包括：MED1‑IDR蛋白、Pol II蛋白、p53蛋白和、p53靶DNA、相分离诱导剂。通过体系诱导p53液滴，监测p53对DNA损伤后修复进程的调控作用，模拟DNA损伤后所形成的修复隔室，可以研究某一个位点的翻译后修饰对p53参与的DNA修复隔室形成的影响，也可以检测其在细胞内的定位，从而解决细胞内p53信号通路复杂、结果不易判定的问题。相分离液滴在局部增加了蛋白的浓度，更加真实的模拟体内不均匀分布的环境；通过标签蛋白，过程和结果可视化。

技术领域

本发明属于分子生物学和细胞生物学领域，具体涉及一种基于相分离研究磷酸化p53稳定性以及细胞内定位的方法。

背景技术

p53基因位于人类17号染色体(17p13.1)的短臂上，编码具有393个氨基酸和十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳检测为53kDa的核内磷酸化蛋白。p53是一种重要的肿瘤抑制因子，参与了与DNA修复、细胞周期阻滞、衰老、凋亡、自噬和新陈代谢相关的许多过程。在未受压力的细胞中，p53通常是一种短暂存在的蛋白质，主要通过其负调控因子MDM2维持在低水平，一旦发生DNA损伤或其他压力，p53就会通过广泛的翻译后修饰(例如磷酸化) 被激活并稳定。例如，Ser392磷酸化可以增加p53的稳定性、增强四聚体形成并调节p53对特定和非特定DNA位点的结合亲和力。

尽管进行了数十年的深入研究，因为p53复杂的信号传导，我们对p53信号级联的理解仍然不完整。细胞内的研究容易受到多种未知因素的影响，体外研究则难以还原p53在细胞内不均匀分布。一方面，虽然p53通常均匀分布在正常细胞核中，但压力下p53可以在局部富集以高效行驶功能；另一方面，在癌细胞和肿瘤组织中常常观察到p53蛋白聚集体，这会导致p53原有功能丧失甚至导致致癌活性。

因此，需要开发一套既可以模拟体内环境，又可以明确单一位点磷酸化所造成影响的p53 体外研究体系。

发明内容

本发明的目的在于提供一种既可以模拟体内环境，又可以明确位点磷酸化所造成影响的 p53体外研究体系。

本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一方面，提供一种体系，包括：MED1-IDR蛋白、Pol II蛋白、p53蛋白和p53 靶DNA，以及相分离诱导剂。

在本发明的一些实施方式中，所述p53蛋白、MED1-IDR蛋白、Pol II蛋白和靶DNA的质量比为(8～12)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：1。

在本发明的一些优选实施方式中，所述p53蛋白、MED1-IDR蛋白、Pol II蛋白和靶DNA 的质量比为10:1:1:1。

在本发明的一些实施方式中，所述p53蛋白为p53蛋白、磷酸化p53蛋白或模拟磷酸化 p53蛋白。

在本发明的一些实施方式中，所述p53蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述模拟磷酸化p53蛋白为SEQ ID NO.2中第392位的丝氨酸突变为天冬氨酸。

在本发明的一些实施方式中，所述MED1-IDR蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述Pol II蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述p53靶DNA的序列如SEQ IDNO.5 所示。

在本发明的一些实施方式中，所述相分离诱导剂为拥挤剂。

在本发明的一些实施方式中，所述拥挤剂占体系的质量比为2～50％，拥挤剂在较大范围内都可以诱导相分离。

在本发明的一些实施方式中，所述拥挤剂为PEG-8000、PEG-600、PEG-4000、Ficoll、 Sucrose。

在本发明的一些实施方式中，所述p53蛋白被荧光标记。