[发明专利]一株牛肠道病毒1型分离毒株及其应用

权利要求书

1.一株牛肠道病毒1型分离毒株，其特征在于，所述分离毒株于2020年10月14日在中国典型培养物保藏中心CCTCC进行用于专利程序的培养物的保藏，其保存号为：CCTCCNo.V202071，分类命名为牛肠道病毒1型EV-E-HN1817；保藏地址为：湖北省武汉市武汉大学保藏中心。

2.根据权利要求1所述的牛肠道病毒1型分离毒株在制备用于预防或治疗牛肠道病毒感染的药物中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，所述药物为疫苗，优选为灭活疫苗。

4.一种牛肠道病毒灭活疫苗，其特征在于，所述疫苗以牛肠道病毒1型EV-E-HN1817为抗原，经灭活制备得到。

5.一种制备权利要求4所述的牛肠道病毒灭活疫苗的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一，病毒原液的制备，将牛肠道病毒1型EV-E-HN1817株接种至生长状态良好的MDBK细胞培养，制备得到疫苗病毒原液；

步骤二，灭活，将检验合格的疫苗病毒原液澄清过滤去细胞碎片，边搅拌边加入10％甲醛溶液，使其终浓度为0.2％，37℃灭活16h，期间不断搅拌，灭活后病毒液于2～8℃保存；

步骤三，疫苗的制备；

步骤四，分装定量分装，压盖，2-8℃保存。

6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤一为：将生长状态良好的MDBK细胞单层弃去培养液，按2％的量吸附接种牛肠道病毒1型EV-E-HN1817株，37℃吸附2小时后加入维持液继续培养，每日观察记录细胞病变情况，当细胞80％以上病变时收获，冻融2次，取样进行半成品检验，测定病毒滴度并将病毒液稀释至10^9.0 TCID₅₀ /mL，即得到疫苗病毒原液，-80℃保存。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤三包括如下步骤：

（1）油相制备：将90重量份注射用白油、5重量份硬脂酸铝混匀并加热至70℃，再加入5重量份span-80，至温度达到115℃时维持40min，冷却后备用；

（2）水相制备：将吐温-80与灭活的病毒液按1:19的体积比例混合，搅拌30-35min使吐温-80完全溶解混匀；

（3）乳化：将油相和水相以1:2体积比例乳化25-30min，取10ml疫苗加入离心管中，4000rpm，离心10min，管底析出的水相≤0.5ml。