[发明专利]一种化学成分明确的用于肌源性细胞体外增殖的培养基

说明书

本发明提供一种用于肌源性细胞体外增殖的化学成分明确的培养基，该培养基通过添加细胞培养补充因子，代替血清在肌源性细胞增殖过程中发挥的作用，来避免血清存在的一系列问题，使肌源性细胞在至少3代(9天)的传代过程中保持每代增殖3倍左右的增殖能力，且活细胞比例维持在90％左右。在分子水平上，本发明的化学成分明确的用于肌源性细胞体外增殖的培养基能够显著提高肌源性基因的表达，同时也显著提高细胞外基质蛋白基因的表达。此外免疫荧光结果显示，本发明的化学成分明确的用于肌源性细胞体外增殖的培养基在传代过程中维持肌源性蛋白、细胞外基质蛋白和细胞特异性蛋白表达的阳性细胞比例，维持细胞种群保持不变。

技术领域

本发明属于干细胞和动物细胞培养肉技术领域，具体地，涉及一种化学成分明确的用于肌源性细胞体外增殖的培养基。

背景技术

肉类因其含有丰富的的蛋白质、碳水化合物、脂肪、矿物质、维生素等营养成分，成为了人类最重要的食物之一，但是传统的畜牧生产肉类的方式存在资源浪费、易传播食源性疾病、威胁动物福利、难以改善肉质等诸多问题，难以成为绿色可持续的肉类生产方式。细胞培养肉技术作为新兴的替代蛋白生产技术，有低碳环保、减少病原体传播、减少抗生素使用、避免动物福利问题等多方面优势，为肉类生产提供了新的途径。

细胞培养肉是依据动物肌肉生长修复的原理，在体外进行干细胞培养获得的肉类，该技术不需要进行动物养殖，而是直接细胞工厂化生产肉类。细胞培养肉的体外生产技术主要分为种子细胞获得与扩增，细胞富集后的诱导分化，进而促使大部分细胞分化形成肌肉组织。因此选择一种在体外能够促进肌源性细胞长期增殖的化学成分明确的培养基至关重要。

目前领域内普遍使用的肌源性细胞的增殖培养基为基础培养基加入10～20vol％的胎牛血清和1vol％双抗。该培养基虽然能够帮助肌源性细胞保持一定的干性并快速增殖，但是由于胎牛血清的添加，存在培养基化学成分不明确、培养基批次间成分不稳定、易出现病原体污染、成本高昂、不利于动物福利等问题。因此，开发一种用于肌源性细胞体外增殖的化学成分明确的培养基变得尤为重要。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明的目的是替代传统肌源性细胞增殖培养基中的血清成分，提供一套化学成分明确的肌源性细胞增殖培养基及其应用方法。

本发明第一个目的是提供了一种化学成分明确的细胞增殖培养基，为无血清成分的细胞培养基。所述的无血清成分的细胞培养基是指培养基配方内不添加有包括胎牛血清、小牛血清、马血清、人血清等任何动物血清成分。所述用于肌源性细胞体外增殖的化学成分明确的培养基是通过添加细胞培养补充因子，实现优异的增殖培养效果，且成分明确易于质量控制，很好的替代了传统肌源性细胞增殖培养基。

本发明技术方案如下：

本发明的第一个目的是提供一种化学成分明确的用于肌源性细胞体外增殖的培养基，所述的用于肌源性细胞体外增殖的培养基包括细胞培养补充因子和细胞增殖培养基，其中不含血清成分。

进一步的，所述细胞增殖培养基包括肌源性细胞基础培养基和青霉素-链霉素双抗溶液；

优选的，所述肌源性细胞基础培养基和青霉素-链霉素双抗溶液的体积比为99：1；

优选的，所述肌源性细胞基础培养基选自DMEM培养基、MEM培养基、DMEM/F12培养基、F10培养基中的一种。

优选的，所述的青霉素-链霉素双抗溶液中，青霉素的含量为10000U/ml，链霉素的含量为10mg/ml。

进一步的，所述细胞培养补充因子包括非必需氨基酸补充剂、脂质、抗氧化剂、重组蛋白、信号通路调节剂、胰岛素、转铁蛋白、乙醇胺、亚硒酸钠、地塞米松、白蛋白、N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸、皮质醇、碳酸氢钠中的多种。

进一步的，所述非必需氨基酸补充剂选自甘氨酸、丙氨酸、天门冬酰胺、天门冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸、丝氨酸中的一种或多种的组合；